1、標本采集
包括痰、膿液、血液、腦脊液等標本。
2、細菌學檢查
痰直接涂片作革蘭染色及莢膜染色鏡檢，如有革蘭陽性、帶莢膜的雙球菌或鏈球菌，可做出初步病原診斷。痰培養24-48小時可確定病原體。10%-20%患者合并菌血癥，應做血培養，血培養檢出肺炎鏈球菌有確診價值。聚合酶鏈反應(PCR)檢測及熒光標記抗體檢測可提高病原學診斷水平。
3、分離培養
常采用羊血平板，有助于其溶血特征的識別和進一步鑒定，而且初代分離應置5%~10%CO2的環境下培養。在血平板上，肺炎鏈球菌的菌落直徑0.5~1.5mm，灰白色、半透明、表面光滑（有些菌株可表現為粘液狀）扁平，周圍環繞著草綠色溶血環。培養或放置24h以上的培養物還會由于肺炎鏈球菌的自溶作用而致菌落中央塌陷而邊緣隆起，而呈臍窩狀。
4、鑒定試驗
① 膽汁溶菌試驗：本試驗的原理基于膽鹽能夠通過活化肺炎鏈球菌的自溶酶而溶解肺炎鏈球菌，但不能溶解草綠色鏈球菌。常用的方法包括快速平板法和標準試管法。前者取一接種環2%去氧膽酸鈉溶液加于血平板待鑒定菌的菌落上，置35℃孵育15~30min，菌落溶解消失為陽性。而后者則是在1ml待鑒定菌18~24h培養液中加入2滴10%去氧膽酸鈉溶液，35℃孵育5-10min后鑒定菌管由混濁變為透明者為陽性。
② 奧普托欣（Optochin）試驗：用以與其他草綠色鏈球菌相鑒別。用接種環將單個待鑒定菌落均勻涂于血平板上，用含量為5μg的optochin紙片貼于接種區中央，35℃需氧培養過夜，抑菌圈 >18mm的為陽性。本菌為陽性。
5、小鼠毒力試驗
若用有毒力的菌株接種小鼠，接種后12-36h，小鼠死亡。