聚丙烯酰胺凝膠電泳儀分析技術

        聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的電泳技術，于1959年建立，1964年進一步從理論和實驗技術上得到改進并推廣應用。由于分辨率高，目前已廣泛用于蛋白質等生物大分子的分析。

一、PAGE工作原理：

        聚丙烯酰胺凝膠具有高粘度和高摩擦阻力，電泳過程中能防止對流，把擴散減到zui小。凝膠具有多孔性，孔徑與蛋白質分子大小大致相同，能產生分子篩效應，其分離既與電荷密度有關，又與分子大小有關，對分離不同相對分子量的生物大分子極為有利。

二、PAGE載體特性：

        采用聚丙烯酰胺凝膠作為載體的目是防止電泳過程中分子的對流和擴散，使待測組分得到更有效的分離。載體應具備以下特性：

  1、物理化學性質穩定，在電泳過程中不受環境因素的影響，保持原有的狀態和性能。

  2、化學惰性，在電泳過程中不與緩沖液中的離子和待分離的生物大分子發生化學反應，不干擾生物大分子的電泳過程。

  3、分布均勻，電滲小，結果重復性好。

三、聚丙烯酰胺凝膠合成方式：

      聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH₂，簡稱Acr）和交聯劑N，N′－甲叉雙丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH－CO－CH = CH₂，簡稱Bis）在催化劑作用下聚合而成的含酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成不帶電荷且具有分子篩性質的三維網狀結構凝膠。參與反應的催化劑有兩種成分，一種是引發劑，提供原始自由基，通過自由基傳遞，使單體Acr成為自由基，引發聚合反應；另一種是加速劑，加快引發劑釋放自由基的速度。

        聚丙烯酰胺凝膠的合成是通過提供氧游離基的催化，使體系發生氧化還原反應來完成，催化體系的實質是自由基催化的氧化還原過程。聚丙烯酰胺凝膠合成方式有化學聚合和光聚合。

  1、化學聚合：

（1）原理：

        引發劑過硫酸銨（AP）在加速劑N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的催化下形成游離氧自由基，即S₂O₈²ˉ→ 2SO₄ˉ，硫酸自由基的氧原子激活單體Acr形成單體長鏈，交聯劑Bis將單體長鏈間連成三維網狀結構。

        Acr和Bis決定孔徑大小，AP和TEMED決定聚合速度。

（2）影響化學聚合的因素：

    1）引發劑和加速劑的濃度：

        引發劑和加速劑的濃度小，聚合速度慢。濃度過大，易導致電泳時燒膠和區帶畸變。

        一般使聚合過程在40～60min內完成。

    2）系統pH：

        在堿性pH時，聚合速度快。在酸性條件時，同樣濃度的溶液，聚合速度慢。

        存在一個zui優pH，以獲得zui優聚合結果。

  3）溫度：

        溫度高，聚合速度快。溫度低，聚合速度慢。

        低溫聚合時，凝膠會變得脆而渾濁，重復性差。在25℃聚合的凝膠，較透明，有彈性。

    4）分子氧：

        分子氧能使AP分解，導致自由基淬滅，阻止多聚體鏈長的增加。

        進行化學聚合時，反應液應與空氣隔絕。

    5）系統純度：

        有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃和一些金屬等會抑制聚合反應，反應液和容器表面接觸的一層不能形成凝膠。

        某些化學物質可減慢聚合速度。

（3）應用：

        PAGE的分離膠（小孔膠）是通過化學聚合法制備而成。

  2、光聚合：

（1）原理：

        引發劑核黃素在加速劑TEMED和光照條件下，分解成無色的還原型（無色核黃素），在少量O₂條件下，還原型核黃素被O₂再氧化形成自由基，從而引發聚合反應。

（2）影響光聚合的因素：

    1）需痕量氧原子存在，但過量的氧會阻止鏈長的增加。

    2）核黃素用量少（4mg/100mL），生物樣品不失活。

    3）光源容易獲取，改變光照量可控制聚合時間。光照量不易掌握，使凝膠孔徑不穩定。

（3）應用：

        光聚合的凝膠孔徑大，適于制備PAGE的濃縮膠（大孔膠）。

四、聚丙烯酰胺凝膠性能指標：

  1、性能指標：

        聚丙烯酰胺凝膠性能指標有凝膠總濃度和交聯度等。

（1）凝膠總濃度（T）：

        凝膠總濃度表示凝膠溶液中單體和交聯劑的總百分含量。

        T = [（a + b）/m]×100%

        式中：a為單體Acr的質量（g），b為交聯劑Bis的質量（g），m為溶液的體積（mL）。

        凝膠總濃度主要影響凝膠篩孔大小。凝膠平均孔徑隨著凝膠總濃度的增大而減小。

        實驗表明，凝膠篩孔的平均直徑和凝膠總濃度的平方根成反比。即：

        D＝kd/（T^1/2）

        式中：D為凝膠篩孔的平均直徑，d為多聚體分子直徑，k為常數。

        凝膠總濃度可在3%～30%之間變化。凝膠總濃度過高，凝膠硬而脆，易破碎。凝膠總濃度過低，凝膠稀軟，不易操作。

（2）交聯度（C）：

        交聯度表示凝膠溶液中交聯劑占單體和交聯劑總量的百分含量。

        C = [b/（a + b）]×100%

        交聯度決定凝膠篩孔的zui大直徑。交聯度過高，凝膠不透明，缺乏彈性。交聯度過低，呈糊狀。要獲得透明而有合適機械強度的凝膠，單體用量高時，交聯劑量應減少；單體用量低時，交聯劑量應增大。

        a和b的比例很重要，決定凝膠的物理性質。

        當a/b＜10時，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色。

        當a/b≈30且T = 3%時，凝膠富有彈性，完全透明。

        當a/b≥100時，即使5%的凝膠也呈糊狀。

        當a＜2%和b＜0.5%時，凝膠不能聚合。

2、良好凝膠的經驗公式：

在100mL溶液中，Acr（g）×Bis（g）≈1.3

zui常用凝膠的組成是T＝7%～7.5%，C＝2%～3%。

標準凝膠的組成是T＝7.2%，C＝2.6%，可較好分離蛋白質。

當分析未知樣品時，常用標準凝膠或4%～10%的梯度凝膠試測，然后確定合適的凝膠總濃度。

3、凝膠總濃度和交聯度與凝膠孔徑的關系：

聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于凝膠總濃度和交聯度。

凝膠總濃度和交聯度與凝膠平均孔徑的關系如下：

（1）凝膠總濃度為6.5%時：

1）交聯度為1%時，平均孔徑為2.4nm

2）交聯度為5%時，平均孔徑為