細胞培養中如何減少污染

污染是細胞培養技術中面臨的主要問題。某些污染的發生往往難以察覺檢測，而且污染源能長期共存于培養體系中，這類染事實上大部分被人們忽視了。

培養的細胞作為個生物體，會對培養環境以及環境中的污染物作相應的反應，造成培養細胞生物學特性的改變，而實驗結果造成潛在的威脅，而且隨著污染時間的長而增加。

培養環境中的物理、化學及生物因素都可能入培養環境造成污染。由于入侵的微生物在培養系中不斷增殖、代謝，因此生物性的污染對細胞的害最大。隨著污染微生物的不斷增殖，交叉污染可能性也不斷增加。此外，微生物代謝消耗大量需的養分，同時產生多種有毒的代謝產物，如酶、抗原及毒素等，進一步對細胞產生毒害作用。因此，識細胞培養污染的途徑及其危害性，建立細胞培規范的操作方法及規章制度，可以有效地防止污染保證實驗體系的穩定性和可靠性。

1、細胞培養基本技術　

為了減少污染對細胞培養的影響，必須建立細胞凍存庫。細胞凍存庫應該分主細胞庫（Master cell bank，MCB）和工作細胞庫（Working cell bank，WCB），當需要做實驗時從主細胞庫中復蘇細胞建立工作細胞庫。每一個凍存標本都應明確記錄細胞的性質、代數及有無污染。同時還應建立規范的檢測程序進行菌檢及細胞鑒定。

為了保證培養細胞系的完整性，必須進行詳細的實驗記錄，應包括以下內容:細胞系的種類及來源、有無污染（如細菌，病毒，支原體）、細胞代數和倍增時間、以及選擇性突變。詳細的記錄有利于對細胞的遺傳及生理特性在常規傳代培養中因突變、污染及各種原因導致的改變進行分析。經過連續傳代培養的細胞與它較早代數的凍存細胞相比，隨著培養時間的延長，細胞在適應環境的過程中，其生物特性已發生了改變。培養的細胞由若干生長速度及活力各異的亞群組成。隨著培養時間的延長生長速，度快及活力高的細胞亞群逐漸占優勢這種選擇性，趨勢會影響整個細胞群的生物特性。應用不同代數的細胞連續進行實驗則結果會發生偏差。建立細胞凍存庫就能避免這種影響通過復蘇相同代數的細胞，人們就能在較為均一的條件下重復實驗。

細胞培養工作需要清潔，保持良好的環境及規范的操作程序。超凈工作臺是細胞培養中普遍使用的無菌操作裝置，它需要合理的布置及經常性的維護。超凈工作臺的工作原理是驅動經高效濾菌凈化后的空氣，通過工作臺面形成氣流屏障，從而阻止外界污染物的侵入并使操作過程中產生的飛沫限制在超凈工作臺中。因為操作過程中可能產生有毒的物質，所以采用垂直氣流比水平氣流安全。
當進行移液，傾倒液體的操作過程會產生飛沫并沉積在超凈工作臺內物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產生，飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當的維護以及不規范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向導致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內物品污染的主要因素造成潛在污染的進一步傳播。因此為減少交叉污染的發生，應盡可能減少超凈工作臺內的物品。不同細胞系以及同一個實驗室不同操作者所使用的培養試劑一定要分開使用，如胰酶、培養液等。否則，一個操作者的失誤可能引起所有細胞發生污染。

2、細胞培養的污染　

細胞培養污染是指培養環境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。細胞培養污染可分為以下三類：物理性、化學性及生物性。為了使細胞培養的結果更可靠，應該固定所有培養條件，并保證其重復性。

2.1　物理性污染的來源、危害及預防　物理性污染常常被人們所忽視或被籠統地歸為化學性污染。物理性污染通過影響細胞培養體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養環境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產生影響。細胞、培養液或其它培養試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。通過實驗室的合理設計及建立規范的操作規程，可以減少環境中物理因素對細胞的影響。孵箱應放在溫度較恒定的環境中，周圍不能放置能引起機械振動的設備，如離心機。培養液及培養試劑應放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養液從冰箱中取出后應在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。

2.2　化學性污染的來源、危害及預防 培養環境中許多化學物質都可以引起細胞的污染。化學物質并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學物質污染的反應是不一樣的。未純化的物質、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。細胞培養的必需養分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養中應嚴格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂（通常殘留在瓶蓋的內表面）是最常見的化學性污染。

2.2.1　水　水是唯一一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細胞的容器時應考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內毒素等物質對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質的超純水。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。

在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機的常規維護后可能有少量的化學物質殘留。為了保證水的純度，我們應采取措施盡量避免化學物質的殘留。

2.2.2　血清　動物血清是細胞培養中常用的天然培養基，但血清又是潛在的生物及化學污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產工藝及質量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養基的成分等因素。在進行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。

2.2.3　培養液、培養附加成分、試劑　培養液、培養附加成分、試劑都可能成為化學性污染的來源。細胞培養使用的所有物質都應是高純度的，并經過權威機構的鑒定，實驗者本人也應對上述成分進行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養液及試劑也是非常重要的，應該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。

2.2.4　培養器皿及容器　細胞培養過程中會使用到各種不同的培養器皿及容器。培養器皿的大小，構形設計可能會影響到培養中氣體交換、濕度、培養液的pH值和細胞生長密度。培養器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養體系產生影響。塑料制品在生產過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質時應選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。

2.3　生物性污染的來源、危害及預防　外界的微生物如昆蟲、節肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細菌、無細胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細胞都可能侵入培養環境引起污染。只要在一個開放的環境中進行培養，都難以避免發生污染。發生污染的可能性取決于操作方法、培養室的無菌環境以及實驗室的規章制度。生物性污染對細胞代謝的影響，可因污染源和細胞的種類不同而表現各異。細菌、真菌或其它微生物污染的檢測可以用不同培養基進行檢查。支原體污染的檢測需要特殊的方法。病毒污染的檢測可以使用許多體內或體外實驗，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉錄酶分析、凝血試驗、紅細胞吸附試驗等。

細菌和真菌的污染較易發現并及時清除，而大多數實驗室對支原體的污染缺乏足夠的認識。為了防止支原體及其它微生物污染的發生和傳播，必須建立規范的無菌操作程序及各種規章制度。支原體歸屬

于柔膜體綱（Mollicutes）的支原體目，它們都具有以下共性：無細胞壁、無細胞壁主要成分———粘肽的表達。支原體與其它細菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很3大。支原體直徑僅有013～018μm，并且變形能力大，故能通過濾菌器。需要指出的是，只要有一個具有增殖能力的支原體就能引起培養體系的污染。一旦細胞被污染，支原體的滴度隨著時間的延長而逐漸升高，最高可至每毫升10克隆。最為致命的是，即使存在很嚴重的支原體污染，細胞外觀可無明顯變化。如果繼續使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細胞做實驗，將會嚴重影響實驗結果。