細胞凋亡檢測實驗——DNAladder法

發生細胞凋亡時，內源性核酸酶被激活，染色體DNA鏈在核小體之間被切割，形成180～200個堿基或其整數倍的DNA片段，將這些DNA片段抽提出來進行電泳，可得到DNA梯狀條帶（DNA ladder）。

凋亡細胞

蛋白酶K醋酸鉀白細胞裂解液Tris-HClNaClEDTASDS乙醇瓊脂糖

離心管離心機水浴鍋電泳儀電泳槽

一、材料與試劑準備
 

1.  材料：凋亡細胞。
 

2.  蛋白酶K（500 μg/ml）， 醋酸鉀氯仿（8 mol/L），無水乙醇，70%乙醇，2%瓊脂糖凝膠。

3.  白細胞裂解液：pH8.0，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，1% SDS。

二、操作步驟
 

1.  收集凋亡細胞：取1～2×10⁶ 個細胞，離心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2 h。
 

2.  洗滌：取出酒精固定的細胞，1 000 r/min離心5 min ，去掉上清液，PBS洗二次。
 

3.  裂解細胞：加400 μl細胞裂解液，充分混勻再加蛋白酶K 100 μl，置65℃水浴消化2小時或過夜。
 

4.  蛋白處理：加75 μl 8 mol/L的醋酸鉀，4℃15 min，再加750 μl氯仿，充分混勻后，10 000 r/min離心10 min后，將上清移至一新的Eppendorf管中。

5.  沉淀DNA：加入750μl無水乙醇，上下輕柔顛倒混合，即可見乳白色沉淀，若不明顯時可置-20℃過夜，12 000 r/min離心10 min，去上清。

6.  洗滌DNA：加1 ml 70%乙醇，混勻，10 000 r/min 離心5 min，去上清。
 

7.  溶解DNA：根據 DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸餾水或TE，37℃溶解。
 

8.  測定DNA濃度。
 

9.  2%瓊脂糖凝膠電泳80 V 2小時。
 

三、結果判斷
 

出現梯狀電泳條帶，最小的條帶為180～200 bp，其他的條帶為其整倍數大小。壞死細胞則出現彌散的電泳條帶，無清晰可見的條帶。正常細胞DNA基因條帶因分子量大，遷移距離短，故停留在加樣孔附近。