伏立康唑的作用機制是抑制真菌中由細胞色素P450介導的14α-甾醇去甲基化，從而抑制麥角甾醇的生物合成。體外試驗表明伏立康唑具有廣譜抗真菌作用。本品對念珠菌屬（包括耐氟康唑的克柔念珠菌，光滑念珠菌和白念珠菌耐藥株）具有抗菌作用，對所有檢測的曲霉屬真菌有殺菌作用。此外，伏立康唑在體外對其他致病性真菌也有殺菌作用，包括對現有抗真菌藥敏感性較低的菌屬，例如足放線病菌屬和鐮刀菌屬。
動物實驗發現，伏立康唑的最低抑菌濃度值與其療效有關。但是在臨床研究中，最低抑菌濃度與臨床療效之間并無相關性，并且藥物的血濃度和臨床療效之間似乎也無相關性。這是吡咯類抗真菌藥的特點。