金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測
1、酶聯免疫法
測定原理：酶標抗體與腸毒素特異結合，加入底物后發生顯色反應。
（1）試劑
①腸毒素酶聯免疫檢測試劑盒。
②洗液：在一個塑料洗瓶內，用 1L 蒸餾水或去離子水稀釋濃洗液（試劑1號）。
③樣品添加劑：試劑2號。
④陽性對照：使用前，試劑3號與洗液按1:100稀釋，稀釋時必須用聚丙烯塑料管。
⑤陰性對照：試劑4號。
⑥結合劑：吸取5mL結合劑稀釋劑（試劑5號）于結合劑（試劑6號）的小瓶內，于室溫下緩慢混合。然后再將6號小瓶的試劑倒入5號小瓶內緩慢混合。
⑦底物：把底物稀釋劑（試劑7號）加入底物（試劑8號）內，在室溫下完全溶解。
⑧終止液：試劑9號。
⑨2％次氯酸鈉。
⑩0.25mol/L PH8.0三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液：稱取 Tris 30.28g，加 800mL 蒸餾水使其完全溶解。加 6mol/L HC1 30mL混勻、調PH8.0，定容1L。
?尿素。
?聚乙二醇（PEG，MW20000）。
（2）設備和材料
①均質器及均質杯（250mL）。
②離心機及離心杯（250mL）。
③磁力攪拌器。
④聚丙烯三角燒瓶（250mL）。
⑤聚丙烯離心管（10mL）。
⑥透析袋（MW12000～14000）。
⑦微量加樣器（1～200μL可調節）。
⑧注射器（5mL）。
⑨塑料洗瓶。
⑩脫脂棉。
?培養箱。
（3）操作步驟
①稱取蘑菇罐頭中的湯和固形物各5g，置于均質杯中，加入0.25mol/L PH8.0的 Tris 緩沖液 100mL，高速均質 3min。
②均質后的混合物轉入離心杯中，以 4500r/min 離心 30min。
③上清液倒入一容器內，待做尿素處理用。
④尿素處理：量取 100mL 上清液，加入 6g 尿素，在聚丙烯三角瓶中混勻，在磁力攪拌器上，25℃緩慢攪拌4～5h。
⑤處理后的樣品液，裝入透析袋內，包埋于 PEG 中，4℃濃縮過夜。
⑥用自來水徹底沖洗透析袋表面的 PEG。
⑦將洗凈后的透析袋浸入 0.25mol/L PH8.0的 Tris 緩沖液中平衡 5min，樣品量不足5mL的可加入 Tris 液補足至 5mL。
⑧將樣品液移入 10mL 離心管中，3500～4000r/min 離心 10min。
⑨準備 1 支 5mL 注射器，加 0.5 cm 厚的脫脂棉并用 5 mL 蒸餾水擠壓緊。
⑩離心后的上清液用帶脫脂棉的注射器過濾。
?測定濾液 PH 值，并根據具體情況用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 調 PH 值為7～8。
?在樣品液中加入 100μL 樣品添加劑（試劑 2 號），混勻，待做 ELISA 試驗。
（4）檢測
①從4℃冰箱中取出試劑盒放至室溫，將小孔插入可拼裝式酶標板的托盤，每一個孔做一個樣品，同時再用兩個孔分別做陽性對照和陰性對照。
②在每孔中加滿洗液，20～25℃浸泡10min。
③棄去洗液，翻轉托盤，倒扣在濾紙上以吸干殘留的洗液。
④每孔加入 200μL 的樣品，同時在陽性對照孔中加 200μL 陽性對照物，在陰性對照孔中加入 200μL 陰性對照物（試劑4號）。在樣品記錄表上記下每一樣品的情況，加蓋，37℃溫育 2h。
⑤取出酶標板，按下列步驟對每一孔用洗液重復洗滌3次。迅速翻轉酶標板，將內容物倒入盛有2％的次氯酸鈉溶液的水槽內。將酶標板倒扣在濾紙上，以吸干殘留的液體。每孔加滿洗液。
⑥每孔中加入 200μL 的結合劑（試劑6號），加蓋，20～25℃，1h。
⑦按照⑤方法重復洗滌 5 次，翻轉酶標板，倒扣于濾紙上以吸干殘留的液體。
⑧每孔中加入 200 μL 的底物（試劑8號），加蓋，20～25℃，30～45min。
⑨每孔中加入 20 μL 終止液（試劑9號），混勻，對照比色卡觀察試驗結果，也可用酶標儀測定每一孔的吸光度，并做好記錄。
（5）結果判定
①陽性對照應顯示為深綠色，且吸光度大于1.0，表明所有試劑有效。
②達到下列標準的樣品被判為陽性。陰性對照在比色卡的陰性范圍內，吸光度小于0.2；樣品的顯色深于或相同于比色卡上陽性范圍的顏色，或吸光度大于0.2。
③達到下列標準的樣品被判為陰性。陰性對照在比色卡陰性范圍內，吸光度小于0.2樣品的顯色在比色卡的陰性范圍內或吸光度小于0.2。
④使用酶標儀，在414nm±10nm 波長可讀取樣品的吸光度。雙波長讀數儀用空氣調零點，第二參考波長應指在490nm±10nm。
⑤若陰性對照的吸光度大于0.2，有可能是酶標板未洗凈，該試驗應重復。
⑥為避免因非特異性反應導致結果出現假陽性，當對樣品陽性結果有懷疑時，可用正常兔血清按1:1的比例與樣品在37℃下作用1h后，重復上述試驗。