離子交換層析(ionexchangechromatography)純化超氧化物歧化酶

原理]
本實驗利用超氧化物歧化酶的解離性質，在一定緩沖液條件下與離子交換纖維素吸附和解吸的能力不同于溶液中雜蛋白，進而除去雜蛋白。實驗中選用DE-32離子交換纖維素。

[試劑和器材]
1、試劑
（1）DE-32
（2）緩沖液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）
（1）緩沖液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6）

2、器材
（1）層析柱(2.5cm × 25cm)
（2）部分收集器
（2）梯度洗脫儀
（3）紫外分光光度計
（4）試管、透析袋

[方法和步驟]
1、DEAE-纖維素的預處理：
（1）稱取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的燒杯中，室溫放置30min，不時輕輕攪拌。
（2）將糊狀物移入3號砂芯漏斗中，用蒸餾水淋洗。如此重復，每加一次去離子水，浸泡一段時間，再進行抽濾，至洗滌液pH等于4即可（pH試紙試）。
（3）將糊狀物移入燒杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不時輕輕攪拌，棄去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再處理一次。
（4）將交換劑移入3號砂芯漏斗中，反復用去離子水淋洗，直至洗滌液pH為8.0（可用pH試紙測試）。
（5）將DEAE-纖維素浸泡在150mL去離子水中。用0.5mol/L 鹽酸把pH調至7.6，滴定可在pH計上進行，須使懸液最終pH在10min內無變化，然后抽濾。
（6）將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75mL緩沖液I，慢慢攪混之后，靜置20min，用傾斜法除去上清液中細微粒子，如此重復若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。
2、裝柱
（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯接塑料管，裝上螺旋夾。關上螺旋夾，柱內裝入緩沖液I，微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關閉螺旋夾。
（2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時的流速要比正常洗脫時的流速慢，陸續加入較多的漿液，直至達到高10cm以上的柱床體積。
3、平衡
當全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進行平衡。流速可維持在4mL/15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）
4、層析
用毛細吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出口使緩沖液Ⅰ恰流到表面，關閉出口。用毛細吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開出口，使樣品溶液進入纖維素內，至幾乎露出床面時，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2～3次，然后裝入緩沖液Ⅰ，使液面高出創面2～3 cm左右。
5、洗脫
（1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。
（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內各裝入100mL緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ，注意兩洗脫瓶，特別是液面應處于同一水平面，同時應排除連接管內氣泡。
（3）開動電磁攪拌器開關，調節攪拌速度，以混合器內緩沖液旋轉而無明顯旋渦為宜。
（4）將兩瓶和柱上下連接管道打開，開始收集洗脫流出液，控制流速在1.5mL／min。 收集液測定蛋白質濃度和酶活性。
（5）收集合并具有SOD活性部分的洗脫液，透析濃縮后冷凍干燥即得純化SOD（淡藍綠色產品）。