相分離過程對細菌功能性淀粉樣纖維的形成有重要作用

　　人類文明的發展史就是一部與微生物相愛相殺的斗爭史。從1928年開始，以盤尼西林（青霉素）為代表的一系列抗生素的陸續發現，使得很多由病原細菌引發的感染疾病得以成功治療，人們曾不止一次認為看到了徹底戰勝病原細菌的曙光 。然而，幾十年來，由于廣譜抗生素、抗菌藥物的大量使用或濫用，各種耐藥性細菌或真菌大量涌現，對全球公共衛生安全構成了巨大挑戰。面對微生物的威脅，人類從未停止過斗爭。揭示新的耐藥機制、尋找新的抗菌靶點成為開發新型抗感染藥物的迫切需求。

　　已有研究表明，80%的細菌感染與生物被膜的形成相關。細菌生物被膜是細菌自身分泌的胞外基質相互粘連形成的，具有特定結構和功能的細胞群體。胞外基質的主要成分為胞外多糖、蛋白質、胞外DNA (eDNA) 和脂質等。生物被膜為細菌提供了機械屏障，可以抵御宿主免疫反應并導致細菌對抗生素及消毒劑的敏感性降低，從而增強它們在宿主和環境中的生存能力；此外，生物被膜內部是一種低氧、低pH、高二氧化碳且缺水的干燥環境，營養物質匱乏，不利于細菌生長代謝。傳統抗生素可能由于生物被膜的屏障作用和生物被膜內細菌生長代謝改變導致其對成熟生物被膜內的細菌沒有作用，生物被膜的形成因而與細菌的耐藥性密切相關，也是造成慢性感染和病情遷延不愈的主要原因。

　　近年來，由多重耐藥性金黃色葡萄球菌引起的院內感染已對全人類的健康構成極大威脅。全球每年有近100萬人死于無法用傳統抗生素治療的細菌感染，其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌造成的死亡病例遠超過由艾滋病和肺結核引起的死亡病例總和。金黃色葡萄球菌的耐藥性往往與其形成生物被膜密切相關。人們很早就在奶牛源金黃色葡萄球菌中發現一種被稱作生物被膜相關蛋白（Biofilm associated proteins）的細胞表面蛋白Bap，Bap在介導葡萄球菌生物被膜的形成中發揮重要作用 。Bap是一個多結構域蛋白，全長蛋白含有2276個氨基酸。最近的研究表明，Bap蛋白的N末端在低pH和低鈣下易于聚集形成功能性淀粉樣纖維，并且促進細菌聚集和生物被膜的形成。然而，Bap蛋白響應環境變化調控淀粉樣纖維的形成以及介導生物被膜形成的機制并不清楚。

　　2021年5月28日，清華大學生命學院方顯楊課題組在EMBO J雜志發表了題為Structural mechanism for modulation of functional amyloid and biofilm formation by Staphylococcal Bap protein switch 的研究論文。該項工作解析了Bap蛋白N末端BSP結構域的1.9 ?的高分辨率晶體結構，該結構呈現啞鈴形折疊，連接N末端和C末端的中間模塊（Middle module，MM）由兩個串聯的全新的鈣離子結合基序組成。盡管該基序曾被預測為可結合鈣離子的EF-hand，晶體結構表明，不同于傳統的EF-hand形成Helix-Loop-Helix的結構并僅結合一個鈣離子，該基序形成了Loop-Helix-Loop的結構而且結合兩個鈣離子，因而是一種全新的鈣離子結合基序。小角X射線散射（SAXS），核磁共振（NMR）和分子動力學模擬數據表明，中間模塊響應鈣離子濃度變化發生從有序到無序的構象轉換。體外和體內的生化實驗表明，BSP的N端在酸性（pH <= 4.5）條件下通過液相-液相和液相-固相相變形成淀粉樣纖維并介導生物被膜形成。該過程受到低鈣離子條件下處于無序構象的中間模塊（MM）的促進，而鈣離子結合可促進中間模塊的緊湊折疊，并與周邊模塊形成相互作用網絡，從而抑制相分離發生以及生物被膜的形成。由于許多細菌都通過Bap形成生物被膜，對Bap蛋白介導金黃色葡萄球菌生物被膜形成的調控機制的揭示，有助于開展相關的藥物設計。

　　Bap形成淀粉樣纖維及介導金黃色葡萄球菌形成生物被膜的調控機制

　　該研究有以下重要發現：

　　1. BSP的N末端包含重復串聯的結構模塊，可作為支架蛋白介導液液相分離，并通過液固相變聚集為淀粉樣纖維。這是迄今為止發現的第一個可經由相分離形成功能性淀粉樣纖維的細菌細胞表面蛋白，表明相分離過程在細菌功能性淀粉樣纖維的形成過程中發揮重要作用。

　　2. BSP的中間模塊作為一種新穎的鈣離子結合基序，其結構與近年來在真核和原核生物中發現的多種鈣離子結合基序完全不同。中間模塊通過感應鈣離子和pH的變化而發生“無序?有序”之間的構象轉變，賦予細菌響應外界環境信號并在特殊條件下生存的能力。

　　3. 在低pH和低鈣離子濃度條件下，BSP的各結構模塊協同性的調控淀粉樣纖維的形成進而介導金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

　　清華大學生命學院方顯楊助理教授為文章的通訊作者, 2016級博士研究生馬俊鋒是文章的第一作者，研究助理程翔，2017級博士研究生徐鐘河，已畢業博士生張一堪對該課題做出了重要貢獻。