CaCl2 法
DOTAP 法
| 實驗方法原理 |
將感興趣的外源基因亞克隆到質粒轉移載體上，外源基因的兩端為痘苗病毒基因組非必需基因片段。隨后，將重組質粒轉染病毒感染的細胞，痘苗病毒基因組與質粒上同源的部分發生同源重組。應用適當的篩選方案，經幾輪噬斑純化，從細胞裂解物中獲得重組病毒。 |
|---|---|
| 實驗材料 | pSCll／pRB21／pSC65／pLW9 ／其他合適載體 CV-1／BS-C-1／ BHK-21 ／CEF 細胞 痘苗病毒儲液 |
| 試劑、試劑盒 | 完全 MEM-10 和 MEM-2.5 培養基 轉染緩沖液 干冰／乙醇 胰酶 CaCl2 |
| 儀器、耗材 | 25 cm2 組織培養瓶 聚苯乙稀管 刮刀／橡皮細胞刮刀 15 ml 無菌錐形離心管 Sorvall 離心機 |
| 實驗步驟 |
1. 將目的基因亞克隆到 pSC11、pRB21、pSC65、pLW9 或其他合適載體的多克隆位點（MCS）上，分離質粒。 2. 將 1 × 106 的 CV-1、BS-C-1，BHK-21 或 CEF 細胞用完全 MEM-10 培養基接種到 25 cm2 組織培養瓶中，培養至接近單層生長至匯片的程度（通常過夜）。 3. 使用前，將等體積的痘苗病毒儲液與 0.25 mg/ml 胰酶混合，渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min，并在保溫過程中每隔 5～10 min 渦旋混勻一次。對于 MVA， 以在冰上超聲 30 s 打散病毒團塊代替胰酶解。病毒儲液的滴度常常在 2 × 109 pfu/ml 左右，但根據其來源的不同病毒滴度也可能低一些。 4. 用完全 MEM-2.5 培養基將病毒稀釋到 1.5 ×107 pfu/ml。在匯片生長的單層細胞培養瓶中吸出培養基，加入 1 ml 稀釋的病毒（0.05 pfu/細胞）轉染。培養 2 h，每隔 15 min 輕輕搖動一次。在轉染結束前 30 min，按照下面介紹的方法制備 DNA。 5. 在 12 mm × 75 mm 聚苯乙稀管中加入 1 ml 的轉染緩沖液，再加入 5～10 μg（<50 μl）含有目的基因的重組質粒（來自步驟 1）。 6. 緩慢地加入 50 μl 2.5 mol/L CaCl2，并輕輕混合均勻，在室溫放置 20～30 min，細小的沉淀應該會出現。 7. 從單層細胞吸去病毒接種物（步驟 4）。 8. 將沉淀的 DNA 懸液（步驟 6）加入細胞，室溫放置 30 min，然后加入 9 ml 完全 MEM-10 培養基 37℃ 培養 3～4 h。 9. 吸出培養基，加入 5 ml 完全 MEM-10 培養基，37℃ 培養 2 天。 10. 用刮刀或無菌的橡皮細胞刮刀，輕輕刮下細胞，轉移到 15 ml 錐形離心管中，5～10℃，1800 g 離心 5 min，棄培養基。 11. 將細胞用 0.5 ml 完全 MEM-2.5 培養基重懸。反復凍融裂解細胞懸液：用干冰/乙醇冷凍使細胞凍結，37℃ 水浴及渦旋將細胞解凍。如此進行 3 次。 12. 將細胞裂解物置 -70℃ 保存，直至篩選步驟進行（見「重組病毒噬斑篩選實驗」）。
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| 注意事項 |
1. 所有步驟必須在生物安全柜中進行無菌操作。 2. 培養都在加濕的 5% CO2 培養箱中 37℃ 培養，除非有特殊說明。 3. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的。 4. 在轉染中不需要包含痘苗病毒 DNA，但加入可以導致高效率的重組。如果要加入，1 μg 痘苗病毒 DNA 混合 5～10 μg 重組質粒 DNA，在加入 CaCl2 前，渦旋混勻以切割大分子質量的 DNA。
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