各電泳法,除另有規定外,照下述方法操作。
一、紙電泳法
1.儀器裝置包括電泳室及直流電源兩部分。常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F,此架可從槽中取出;兩側電泳槽A內的鉑電極D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。電源為具有穩壓器的直流電源,常壓電泳一般在100~500V,高壓電泳一般在
500~10 000V。
2.操作法
(1)電泳緩沖液枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)取枸櫞酸(C6H8O7·H2O)39.04g 與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。
(2)濾紙取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,備用。可按需要裁成長
27cm、寬18cm的濾紙,或根據電泳室的大小裁剪,并在距長度方向一端5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm處做一記號備點樣用。
(3)點樣有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中,濕潤后,取出,用濾紙吸干多余的緩沖液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩沖液中,然后用微量注射器精密點加供試品溶液,每點10μl,共3點,并留2個空白位置。干點法是將供試品溶液點于濾紙上,吹干、再點,反復數次,直至點完規定量的供試品溶液,然后用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最后噴濕,本法適用于稀的供試品溶液。
(4)電泳于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為18~20V/cm,電泳約1小時45分鐘,取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
(5)含量測定剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙,剪成細條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置
1小時,用3號垂熔玻璃漏斗濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項下的規定測定吸收度,并按吸收系數計算含量。
二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1)巴比妥緩沖液(pH8.6)取巴比妥2.76g,巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2)氨基黑染色液取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3)漂洗液取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。
(4)透明液取冰醋酸25ml,加無水乙醇75ml,混勻。
3.操作法
(1)醋酸纖維素薄膜取醋酸纖維素薄膜,裁成2cm×8cm的膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾于濾紙中,輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。
(2)點樣與電泳于膜條上距負極端2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在10~12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以 4~5cm為宜。
(3)染色電泳完畢,將膜條取下浸于氨基黑染色液中,2~3分鐘后,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色為止。
(4)透明將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10~15分鐘,取出平鋪于潔凈的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度計上測定和作標本長期保存。
(5)含量測定未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定,一般采用洗脫法或掃描法,測定各蛋白質組分的相對百分含量。洗脫法將洗凈的膜條用濾紙吸干,剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶,分別浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中,振搖數次,至洗脫完全,于一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位,同法操作作對照。先計算吸收值總和,再計算各蛋白組分所占百分率。掃描法將干燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖,橫坐標為膜條的長度,縱坐標為吸收度,計算各蛋白組分的百分含量。亦可用微機處理積分計算