用GST融合蛋白檢測蛋白質蛋白質相互作用實驗

結合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白

堿性緩沖液 封閉緩沖液 相互作用緩沖液PK 緩沖液 還原型谷胱甘肽于 Tris-Cl中 洗滌緩沖液 1 洗滌緩沖液 2 蛋白酶 蛋白激酶 A [y-32P]ATP

與待篩選蛋白結合的膜或濾膜 Sephadex G-50 轉柱

材料

緩沖液和溶液
將緩沖液稀釋到適當濃度。

堿性緩沖液
20 mmol/L HEPES(pH7.5)
50 mmol/LKCl
10 mmol/LMgCl₂
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
0.1%NP-40

封閉緩沖液
5% 脫脂奶粉于堿性緩沖液中

相互作用緩沖液
1% 脫脂奶粉于堿性緩沖液中

2xPK 緩沖液
100 mmol/LKPO₄(英文版原書如此—譯者注）
20 mmol/LMgCl₂
10 mmol/LNaF
9 mmol/L 二硫蘇糖醇

還原型谷胱甘肽（20 mmol/L) 于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
可選，請見步驟 3

洗滌緩沖液 1
磷酸緩沖鹽溶液，含 0.2%TritonX-100

洗滌緩沖液 2
磷敢緩沖鹽溶液，含 0.2%TritonX-100 和 100 mmol/LKCl

酶及緩沖液

蛋白酶
可選，請見步驟 3。

蛋白激酶 A
每次使用時按產品說明新鮮配制。

放射活性化合物

[y-³²P]ATP(6000Ci/mmol)

專用設備

與待篩選蛋白結合的膜或濾膜。
請見步驟 5。

Sephadex G-50 轉柱
可選，請見步驟 4。

附加試劑

此方案步驟 3 需要一些試劑，它們可將融合蛋白從其載體上或結合的谷胱甘肽-瓊脂糖上切割下來，見 15 章方案 5。
此方案步驟 5 需要含待檢測蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠（請見附錄 8) 或含 cDNA 表達文庫的板（請見 14 章方案 2），以及附錄 8 中描述的免疫印跡試劑。
單獨的 GST 或一種非特異性蛋白質的陰性對照應當和靶蛋白一起加入到 SDS 聚丙烯酰胺凝膠中。如果目標蛋白是一保守家族的成員，目標蛋白的相互作用可與同一家族的其他蛋白質進行比較。

載體和菌株

結合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白
這一方案適合于融合蛋白中含蛋白質激酶磷酸化位點的蛋白質（Ron and Dressler 1992)。還可采用含 cAMP 依賴的蛋白激酶識別序列的載體（Amersham Pharmacia Biotech 公司）。如果使用非標記的 GST 融合蛋白，請參見本方案結束處的文本框，“替代方案：用抗 GST 抗體檢測蛋白質-蛋白質相互作用”。

方法

放射標記蛋白探針的制備

1. 在微量離心管中制備下列反應混合物：

[γ-³²P]ATP(6000Ci/mmol）                               5ul

蛋白激酶 A                                                        1unit/ul
 
在谷胱甘肽瓊脂糖上的 GST 融合蛋白               1~3ug

2XPK 緩沖液                                                       12.5ul

水                                                                        到 25ul

反應混合物在 37°C 孵育 30 min。

在標記反應進行前融合蛋白可被蛋白酶切割。在此情形下，用切割蛋白替代標記反應中結合到谷胱甘肽瓊脂糖上的蛋白質，37°C 孵育 30 min, 然后接續步驟 4。
GST 成分保留在融合蛋白上，要用 GST 本身（結合到谷胱甘肽瓊脂糖）做對照重復此實驗。在文庫篩選時這可能不太實際，因此重要的是測試陽性克隆與 GST 本身結合的能力。這一對照通常在第四次純化后、克隆鑒定前進行。

2. 標記反應完成后，加入 200ul 的 1XPK 緩沖液到離心管中清洗瓊脂糖珠，然后在微量離心機上以最大速度離心 1 min。用適當的方式將含游離放射性核酸的上清棄去，再重復清洗一次。

3. 用一種蛋白酶切下標記蛋白質，或用 20 mmol/L 還原型谷胱甘肽于 50 mmol/LTris (pH8.0) 中（請見 15 章方案 5) 將標記的 GST 融合蛋白從瓊臘糖珠上洗下。將標記蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。

4. 在標記反應前如果標記蛋白與 GST 成分分開（請參見步驟 1 的注意事項)，就將標記蛋白上用 1XPK 緩沖液平衡的SephadexG-50 柱，以除去游離的標記核酸。探針蛋白一旦與游離核酸分開，就可使用。將標記蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。

探測膜

5. 用標準技術將蛋白質轉移到膜上，制備待檢測的膜。
從 SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉移的蛋白質通常可以直接被檢測。如果蛋白質從 cDNA 表達文庫中轉移，則在進入到步驟 6 之前，可要進行附加方案：“膜結合蛋白的再折疊”。

6. 用堿性緩沖液完全覆蓋膜并在 4°C 輕輕震蕩淸洗 10 min。

7. 棄去堿性緩沖液，用封閉緩沖液完全覆蓋膜，并在 4°C 輕輕震蕩孵育 4 h 到過夜。

8. 加人 1~3ug 的貯存探針（來自步驟 3 或 4) 到足夠的相互作用緩沖液中，使終濃度為 1~5nmol/L, 制備標記蛋白溶液。將膜轉移到含稀釋探針的平皿中，確認探針溶液與膜的整個表面均勻接觸。4°C 輕輕震蕩孵育 4~5 h。

9. 以適當的方式棄去放射性探針溶液。用洗漆緩沖液 1 完全覆蓋膜，并在 4°C 輕輕震蕩孵育 10 min。重復洗滌三次。

10. 用洗滌緩沖液 2 完全覆蓋膜，并在 4°C 輕輕震蕩洗滌 10 min。重復洗滌一次。

11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。