生物反應器的乳腺生物

乳腺生物

將所需目的基因構建入載體，加上適當的調控序列，轉入動物胚胎細胞，使轉基因動物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。從融合基因轉入胚胎細胞到收集蛋白質有一個過程，包括胚胎植入、分娩和轉基因動物的生長。轉基因動物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個月；并且只有雌性動物泌乳且不連續，一般可持續2、6、10個月。牛、羊等大型家畜能對藥用蛋白進行正確的后加工，使之具有較高的生物活性，同時產奶量大，易于大規模生產，因而成為乳腺生物反應器理想的動物類型。

抗凝血酶Ⅲ

第一個進入臨床試驗的轉基因蛋白產物是抗凝血酶Ⅲ，將半乳糖β-酪蛋白的啟動子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉入綿羊胚胎細胞，在轉基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產量可達7g/L[2]。目前該蛋白正用于冠狀動脈旁路手術患者的二期臨床驗證。

β-乳球蛋白

在實驗過程中人們發現牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常穩定，并能在乳腺中特異性表達。Hyttinen等[3]將含有5'端2.8kb和3'端1.9kb的牛BLG基因片段構建成載體，轉入小鼠胚胎細胞，可在轉基因小鼠的乳腺中特異表達高水平的BLG，此外，還發現CpG位點的甲基化程度與BLG的表達量有關，甲基化少的轉基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達1～2mg/ml，而其他轉基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。

紅細胞生成素

（EPO） 目前國內外均采用CHO細胞表達生產人EPO，成本比較昂貴，而用轉基因動物生產的EPO，可能是一條理想的途徑。將EPO dNA分別以HindⅢ和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+）載體，再將867bp的BLG啟動子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點，構建表達載體pGEM-3zf(+）β-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉基因小鼠乳汗中的EPO含量可達0.5μg/ml[4]。

生物反應器

生物反應器

α1-抗胰蛋白酶這也是一個利用BLG基因構建的重組蛋白。將BLG5'末端4.0kb序列與人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一個內含子）融合，再連接羊的BLG啟動子，以pPOLYⅢ-Ⅰ為載體，轉入羊的胚胎細胞，可在轉基因羊分泌的乳液中得到含量高達60.0mg/ml的重組蛋白α1AT[5]。轉基因在兩年前進入了臨床驗證。

因子Ⅸ

Schnieke等[6]將羊的BLG基因5'末端和人的因子Ⅸ cDNA 與含有BLG復制單元和3'末端的片段融合，將構建的雜合基因轉入羊的胚胎細胞，從分泌的乳汁中得到125μg/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等[7]構建了一個含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因調控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺組織特異性表達載體pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全長hF Ⅸ cDNA ，800bp經過改造的內含子1序列和hFⅨ蛋白的信號肽序列。將線形化的表達載體pMC Ⅸm導入羊的受精卵。轉基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實驗中，Yull等[8]將BLG5'末端序列，fⅨ編碼序列和缺失隱性3'端連接點的f Ⅸ3'末端不翻譯區域的一個小片段融合，構成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉入小鼠胚胎細胞，得到的重組蛋白產量達0.06mg/ml。經過進一步研究，發現是轉基因動物乳腺中對DNA的錯誤剪切使分泌量降低，從而增高重組蛋白產率。在乳腺組織中表達有完全活性的因子Ⅸ是比較成功的，尤其是乳腺組織對因子Ⅸ N端附近的一段含12個葡萄糖殘基的序列進行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒有發現γ-羧化作用。

因子Ⅷ

人FⅧcDNA長約7.2kb，是目前為止表達的最長cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重組蛋白。在WAP/FⅧcDNA構建的轉基因小鼠中rFⅧ表達最低，而在轉基因豬中可達1.0～2.7μg/ml[9]。

單克降抗體

Castilla等[10]將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因組的第一個外顯子，使rMab 6A.C3的表達可以由WAP基因調控序列來控制，將構建的雜合基因注入小鼠胚胎細胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉基因表達產物將廣泛應用于預防新生兒腸道感染。

C蛋白

同樣在WAP基因的第一個外顯子位點，Drews等[11]將人C蛋白cDNA插入，轉入小鼠胚胎細胞，可得到產量達1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉入豬的胚胎細胞，可使豬分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依賴于輕鏈膜結合區域正確的γ-羧化，因此，轉基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細胞可對C蛋白前體高速率地進行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。