溶菌酶分離純化及酶活力、蛋白濃度測定1

一、實驗目的和內容

目的：1. 通過本次實驗的學習和操作，要求學生掌握離子層析的原理以及離子交換層析的操作方法；

2. 掌握離子交換樹脂的再生和保存；

3．掌握比色法測定溶菌酶的酶活。

內容：采用離子交換層析對實驗二獲得的初提液，進行進一步的分離純化以得到較高純度的溶菌酶。具體來說包括：

1．離子交換層析分離純化溶菌酶的操作過程：離子交換柱的裝填、處理、平衡、上樣、洗脫與再生以及保存；

2．溶菌酶的活性測定；

3．用標準曲線測定蛋白質濃度

二、實驗儀器與試劑

1. 實驗儀器：

分部收集器，核酸蛋白質檢測儀，記錄儀，高速離心機（可用50mL離心管），冰箱，可見光分光光度計、搖床、燒杯、玻璃棒、漏斗、濾紙

2. 實驗材料及試劑：

　　樣品S1、S2、S－2，CM-Sepharose F.F.，0.02mol/L pH8.0的PBS，0.5mol/L NaCl，燒杯（50mL，250mL）、枯草芽孢桿菌過夜培養物（37℃，18h，160r/min,100/250mL）、0.02mol/L pH8.0的PBS(測活緩沖液, 含50mmol/L NaCl), 0.02mol/L pH8.0的PBS(離子交換洗脫溶液，含0.5mol/L NaCl)

三、實驗步驟

（一）溶菌酶的分離純化

1. 裝柱

取20mL CM-Sepharose FF，1.0*20cm層析柱，以0.02M PBS,pH8.0為緩沖液裝柱。裝柱方式與第一次課大家裝填分子篩層析柱的方法一樣。注意不能使樹脂露出水面，因為樹脂露于空氣中，當加入溶液時，樹脂間隙中會產生氣抱，而使交換不完全。對于重復使用的填料，需要先沖3倍柱床體積蒸餾水，將保存用的乙醇洗脫出來。

2. 平衡

用泵將3倍柱床體積的0.02M PBS pH8.0過柱。這一步的作用是使得柱床體系的內外達到平衡與均一，以利后續目的蛋白的結合。

3. 上樣

用泵將S－2樣品泵入層析柱，經過一段時間之后，蛋白將通過離子交換的方式，與介質相互作用而掛柱。注意觀察并記錄280nm下吸收值的變化。

4. 沖平

用3～4cv 0.02mol/L pH8.0的PBS 洗滌離子交換柱至無穿透峰為止，流速約1.5mL/min。在吸收峰下降段留樣S3，取約1mL于Ep管－20℃凍存備用)
5. 洗脫

用100mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH8.0的PBS和100mL 0.02mol/L pH8.0的PBS進行梯度洗脫。

收集洗脫峰，記錄洗脫時間和洗脫峰體積V4。取0.5mL清液并加入等量40％甘油于1mL Ep管中，制備2管，-20℃備用（留樣S4）

6. 再生

用泵將2倍柱體積的2mol/L NaCl過柱，然后水洗4倍柱體積。

洗脫完成后，需要進行離子交換填料的再生處理。離子交換基團為一些鹽所覆蓋，影響下次的重復使用。因此，先用高濃度的鹽將與介質結合緊密的雜質洗脫下來，然后再恢復其離子交換功能。對于CM-sepharose 而言，只需要用水過柱即可以使其離子交換功能得到恢復。

7. 保存

用泵將2倍柱體積的20%乙醇過柱。介質回收用于蛋白質分離純化的介質多保存于液體中。保存時需加入一些抑菌劑，如疊氮化鈉等。對于本介質，只需采用20%乙醇保存即可。

對于洗脫下來的樣品，我們無法確證是否含有溶菌酶。因此需要進行監測。一般采取活性監測的方式。本實驗中利用溶菌酶水解枯草芽孢桿菌細胞壁，使得枯草芽孢桿菌裂解，以595 nm下光吸收值的變化來確定溶菌酶所在的吸收峰。

（二）溶菌酶的活性測定

取6mL枯草芽孢桿菌的過夜培養物，3500rpm常溫離心5分鐘，棄上清，沉淀用6mL 0.02mol/L PBS緩沖液懸浮，利用可見光分光光度計測其OD595并記錄（吸光度在0.5～1.0范圍，如果讀數過高可適當稀釋）。比色皿編號見下表，其中1只加入PBS作為儀器調零空白，2作為對照，3、4用于平行測定然后取平均值），30s測定一次吸光度值，約 3min內至吸光度達到穩定。

在室溫，以1號管為對照，每隔30s分別測定2、3、4在595nm的吸光度。（因儀器數量有限，請各組錯開時間進行，確保儀器準備完畢才加入酶液）

觀察懸液OD₅₉₅反應前后的變化。根據以下的酶活定義，測定溶菌酶S1～S4活性。其中活力單位（U）：酶在室溫（25℃），pH8.0條件下，OD₆₅₀每分鐘降低0.001為1個活力單位U。處理數據后完成下表：

四、注意事項

1．離子交換樹脂再使用前需要再生，陰離子交換樹脂以“堿酸堿”的順序進行處理，陽離子交換樹脂以“酸堿酸”的順序進行處理和再生。裝柱時要求粒度均勻，比較致密，柱床表面平整，柱中無裂縫，氣泡和溝流的現象。