液體活檢在臨床腫瘤診療的應用和醫學檢驗實踐（二）

(六)耐藥機制探索

1．ctDNA在耐藥機制探索中的應用：

ctDNA在反映靶向治療獲得性耐藥中具有天然優勢，通過高靈敏度方法追蹤ctDNA變異情況，進而繪制腫瘤獲得性耐藥基因變化演進圖譜有助于揭示耐藥新機制，發現新的治療靶點[40,41]；在發現特定亞克隆與耐藥關聯性的基礎上，深入分析耐藥克隆亞群并探究其分子機制，可為逆轉獲得性耐藥提供充分的轉化依據[42]。因此，ctDNA是一種非常理想的耐藥機制探索切入點。需要注意的是，目前此領域的研究正處于起步階段，還不足以引入臨床實踐。

2．CTC在耐藥機制探索中的應用：

CTC本身作為腫瘤轉移/復發的"種子"，其展現出的干細胞樣特征、上皮－間充質轉化特征、以及極強的耐受能力都提示其是腫瘤演進過程中耐受治療的生力軍與基石[43]。已有研究證實通過分析CTC基因譜可揭示化療耐受的具體機制，并藉此逆轉耐藥[44]。但是目前此領域研究仍局限于極小部分的患者，對腫瘤的異質性與復雜性考慮并不充分，廣泛性仍有待驗證。

液體活檢應用范圍：

共識4　推薦液體活檢應用于無法獲取組織標本的患者。

共識5　ctDNA檢測可應用于指導肺癌EGFR靶向藥物選擇與伴隨診斷，ctDNA可能用于療效監測、早期輔助診斷及腫瘤進展與不良預后早期預警，但現階段僅限于科研探索。

共識6　CTC檢測可用于轉移性結直腸癌、乳腺癌與前列腺癌的進展/不良預后早期預警，但其指導用藥、療效監測、靶向藥物伴隨診斷及早期輔助診斷作用現階段僅限于科研探索。

第二部分　液體活檢的醫學檢驗實踐

一、實驗室的總體要求

(一)實驗室環境要求

液體活檢實驗室對于場地的空間、環境(溫度、濕度、電壓、水質)和分區有嚴格要求。建議根據開展項目預留出儀器和輔助設備的裝載空間，以及操作和數據處理的工作空間。儀器不可直接安裝于空調下方和陽光直射處，四周應留出適當空間便于日常操作、定期維護保養和檢修。實驗室溫濕度等環境因素應嚴格參照廠商建議的最適工作條件設定，以保證儀器正常運行。為保證儀器檢測性能的穩定和可靠，建議配備穩壓的連續不間斷電源。實驗室應根據實際用途，制定適宜的水質標準，定期質檢。

涉及核酸檢測的實驗室，各工作區空氣及人員流向需嚴格參照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》配置，工作中有嚴格避免污染的措施：(1)前處理和建庫時，建議避免低濃度標本與高濃度標本分開，如胸腔積液、腹腔積液標本與血液、腦脊液和尿液標本分開，避免標本間的交叉污染；(2)擴增前后的操作步驟分開，避免擴增產物污染非擴增區；(3)影響檢測結果的特異處理步驟應獨立分區。樣品制備區及其他分區需要時應配備通風柜或超凈臺，實驗室應配置固定和移動紫外線燈，波長為254 nm，照射時離實驗臺的高度一般為60～90 cm。

涉及細胞培養時，操作人員必須更換、穿戴好工作服、鞋、帽和口罩方能進行實驗。有關細胞培養的操作均在超凈臺上完成，嚴格按無菌程序操作，所有進入細胞培養室的人員都必須遵守實驗室有關的規章制度。

(二)實驗室安全要求

依據《中華人民共和國衛生行業標準－臨床實驗室安全準則》、《中華人民共和國國家標準實驗室生物安全通用要求》和《危險化學品安全管理條例》等相關文件，實驗室應制定適當的安全防護措施。實驗室需安裝安全沖淋設施和洗眼器。實驗過程中使用的化學危險品應貼有成分標簽，按說明要求分類儲存、雙人雙鎖。依據《醫療衛生機構醫療廢棄物管理辦法》，結合實際情況，對實驗過程中產生的固體、液體危險廢棄物的收集、存放和處理原則。建議實驗室責任人定期組織實施安全評估。

(三)人員要求和資質

實驗室管理者應監督液體活檢項目的順利實施和開展，為臨床提供精準的個體化醫療服務，并確保實驗室設備設施的完善、分區環境和生物安全符合相關法規和條例，同時指導實驗室人員的規范化流程培訓和教育。

建議開展液體活檢項目的實驗室根據需求配備具有臨床檢驗、臨床腫瘤學、遺傳學、分子生物學、及生物信息分析學科背景的多類跨學科的人員。實驗操作人員需熟練掌握分子生物學理論與技術、經技術相關的理論和操作實踐培訓，通過技能考核，獲得上崗資質后才能正式上崗，在崗期間仍需定期培訓和考核。特殊技術人員(如CTC形態學觀察人員等)在崗期間除定期個人培訓和考核，還需完成人員間比對考核。初學人員建議在有經驗人員的指導下完成操作。生物信息分析人員應兼具生物信息學、分子生物學和(或)臨床醫學專業背景。報告簽發需由獲得中級及以上職稱，具備分子生物學、遺傳學和臨床醫學等多種專業背景，從事腫瘤液體活檢相關工作2年及以上，經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人(高級職稱或醫學博士學位)執行。

(四)規范化文件

1．實驗室必須根據實驗室的質量管理體系與法規要求撰寫規范化文件。實驗室規范化文件如表3所示。

表3 實驗室規范文件列表

2．液體活檢實驗方法的執行：實驗室主任需要確保液體活檢實驗方法在開展前完成檢測性能確立與臨床應用評估、建立完善的質量控制體系、編寫從標本采集到結果解釋全過程的規范化操作規程并且簽字許可新的液體活檢實驗方法認證報告以及執行。

二、體液標本選擇、采集和預處理

(一)體液標本選擇一般規律

在臨床實踐過程中，應綜合考慮到患者病灶累及部位、轉移情況的復雜性、不同體液標本的特征，優先選擇液體活檢靶標最易檢出部位標本(例如廣泛腹腔/盆腔轉移患者可優選腹水；中樞轉移性腫瘤可優選腦脊液)；針對難以判斷的患者，建議聯合多種體液標本的檢測結果，為臨床勾勒腫瘤演化的全貌，提供多維的腫瘤患者診療的圖譜。體液標本選擇一般規律如表4所示：

表4 體液標本選擇一般規律

液體活檢實驗室建立要求：

共識7　臨床液體活檢實驗室必須遵循相關法規，有嚴格避免污染的措施并且定期核查評估。

共識8　建議開展液體活檢項目的實驗室根據需求配備多類跨學科人員。

共識9　報告的審核和發布須由從事液體活檢相關工作2年及以上、經培訓合格的本單位執業醫師或者授權簽字人(高級職稱或醫學博士學位)執行。

(二)標本的采集和預處理

體液中存在較強的背景干擾，加之液體活檢的信息源極其微量，易在分析過程中出現偏差，因此液體活檢對分析全過程的要求相對較高，尤其在標本預處理步驟需避免背景細胞或核酸ctDNA和CTC的稀釋作用，同時進一步防止對CTC的破壞和對ctDNA片段化以及降解，導致最終假陰性結果。

1．體液ctDNA：

臨床實驗室能實現多種不同體液標本內ctDNA的檢測，本應用建議僅概述常見體液標本處理的基本原則，對于其他體液標本的處理建議參考權威文獻或抽提試劑盒的說明。

(1)血漿：目前研究表明最佳的標本類型為血漿，且最好采用含細胞穩定劑的抗凝管或者EDTA抗凝管采集血液。常規采集流程如下：肘部采集靜脈血10 ml(采血量視具體情況而定，建議不少于10 ml，避免因標本量不足導致假陰性結果)，避免凝血、溶血及空腹狀態。若選擇EDTA－K2抗凝采血管，采血后輕柔顛倒8～10次，采集完畢即刻送至檢測實驗室，建議冰浴送檢，防止白細胞裂解。建議2 h內進行兩步離心完成血漿分離，分離后的血漿可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提；若選擇Streck采血管(特殊抗凝劑和保護劑)，采血后輕柔顛倒8～10次，采集完畢無需即刻送至檢測實驗室(可室溫保存3～5 d)，常溫轉運保存即可。建議在7 d內進行兩步離心完成血漿分離，分離后的血漿可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。兩步離心法：在低溫(4 ℃)條件下，先以1 900×g轉速將標本離心10 min，吸取上清，再以16 000×g轉速離心10 min，最終獲得無細胞的血漿標本。

(2)胸腔積液、腹腔積液：臨床醫師通過胸膜腔或腹腔穿刺術，采集胸腔積液或腹腔積液20 ml置于預添加EDTA抗凝劑的無菌容器中(采集量視具體情況而定)，采集完畢應即刻送至檢測實驗室，常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟)，分離后的上清可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。

(3)尿液：留取隨機中段尿20 ml置于無菌容器(采集量視具體情況而定)，采集完畢應即刻送至檢測實驗室，常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟)，分離后的上清可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。

(4)腦脊液：臨床醫生通過腰椎穿刺術，采集腦脊液2～5 ml置于無菌容器(采集量視具體情況而定)，采集完畢應即刻送至檢測實驗室，常溫保存。建議2 h內完成兩步離心分離上清(同血漿分離步驟)，分離后的上清可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。

(5)唾液：患者在標本采集前1 h內應禁食、禁飲、禁煙以及禁止口腔清理程序。采集早晨9～10點的唾液標本置于無菌容器，采集完畢應即刻送至檢測實驗室，常溫保存。建議2 h內完成低溫2 600×g離心15 min并分離上清，分離后的上清可直接進行抽提或保存于－80 ℃冰箱直至抽提。

2．外周血CTC：

肘部采集靜脈血10 ml(采血量視具體情況而定，建議不少于10 ml，避免因標本量不足導致假陰性結果)，避免凝血或溶血。采血完畢應即刻送至檢測實驗室，常溫保存。若選擇EDTA－K2抗凝采血管，建議24 h內完成檢測；若選擇專用細胞保存采血管，建議72 h內完成檢測。

三、液體活檢技術的優化和驗證

在正式應用于臨床前，應對檢測技術或實施流程逐步優化，并完成相關性能驗證或確認。各實驗室在進行性能驗證時，可結合自身特點與檢測項目需求，在本章節設定框架下制定合適的性能驗證流程。若優化實施要素，建議對檢測技術或實施流程進行再驗證或確認，以保證優化后的性能符合檢驗和臨床要求。再驗證或確認的程度和范圍視優化的要素和程度而定。驗證或確認必須貫穿整個實驗流程。

體液標本選擇、采集和預處理：

共識10　體液標本選擇時應綜合考慮腫瘤來源、腫瘤部位、播散途徑、以及不同體液標本的特征，綜合考慮以期提高檢驗效率。

共識11　標本預處理應遵循快速、穩定的原則，針對不同標本采用不同方案進行處理，盡可能保證待測物質的穩定性和濃度，確保檢測質量。

(一)基于PCR方法(包括ARMS和dPCR)ctDNA檢測體系的性能驗證

分析性能驗證項目應包括特異性、敏感度、測定下限、重復性、準確性、抗干擾能力六項。驗證具體內容應遵循CLSI相關文件指示，具體參考如表5所示。

表5 ARMS定性檢測方法性能驗證參考文件

(二)基于NGS方法ctDNA檢測體系的性能確認

NGS方法性能確認須包含陽性預期值(Positive Predictive Value, PPV)、陽性百分比一致性、重復性、可報告范圍/參考范圍、最低檢出限、抗干擾性能、臨床有效性、及生信分析流程確認。確認具體內容應遵循CAP相關共識文獻指示，具體參考如表6所示。

表6 NGS檢測方法性能驗證參考文獻

對已完成性能確認的檢測體系進行改進或改動時，僅需依據體系改變部分作出相應驗證即可，無需重新進行完整系統驗證。

(三) CTC檢測體系的性能驗證

CTC檢測體系應依據相應EP文件對其精密度、正確度、可報告范圍、參考范圍進行性能驗證，具體參考如表7所示。

表7 CTC檢測體系性能驗證參考文件

液體活檢技術優化和驗證：

共識12　商品化ARMS方法的檢測體系應當遵循相關EP文件驗證其敏感度、特異性、測定下限、重復性、準確性、以及抗干擾能力。

共識13　基于NGS方法檢測體系須行陽性預期值、陽性百分比一致性、重復性、可報告范圍/參考范圍、最低檢出限、抗干擾性能、臨床有效性、及生信分析流程確認；如對已完成性能確認的檢測體系進行改進，僅需依據體系改變部分作出相應驗證即可，無需重新進行系統驗證。

共識14　CTC檢測體系應當遵循相關EP文件驗證其精密度、準確度、可報告范圍、參考區間；如基于其他方法的CTC檢測體系則須在前述基礎上再行檢出限、干擾及攜帶污染驗證。

四、質量管理

實驗室質量管理體系分為質量保證和質量控制，需貫穿液體活檢的整個實施流程，即從分析前、分析中到分析后。完善的質量管理和控制用于確保檢測系統穩定性和結果可靠性，有效避免誤差，為臨床腫瘤診療提供更為準確的證據。

(一)質控品的選擇

質控品選擇在質量管理中具有關鍵性作用。應按照定性或定量的實驗目的選擇合適的質控品，以期達到理想的質量管理質量。質控品選擇標準如表8所示。

表8 液體活檢質控品選擇標準

(二)分析前質量管理

關注患者狀態，標本采集時的患者狀態將影響檢測結果，如基礎狀態、治療方案、腫瘤轉移情況，因此選擇適當的采集時間點極為重要。確保患者在標本采集前兩周前未進行化療或放療，以避免假陰性的結果；對存在嚴重炎癥的腫瘤患者，建議在白細胞恢復正常水平后再行檢測，以避免假陰性結果；推薦早晨空腹采取靜脈血，以防止油脂影響DNA提取和檢測。標本采集、運輸和預處理：嚴格按照液體活檢標準操作程序(standardoperating procedure, SOP)實施，如有疑問請及時與臨床聯系和反饋。避免標本存在溶血、凝塊和脂血等情況，以保證后續檢測結果的準確和可靠。

(三)分析中質量管理

抽提模板質控：凡下游涉及PCR或測序等方法，建議采用多種方法對模板核酸的質量進行評估，包括純度、濃度和完整性，以確保滿足檢測平臺的最低要求。

1．室內質控：

為監測分析過程中的每個步驟，要求質控品與標本的操作步驟基本相一致。建議優選商品化的質控品，若缺乏商品化產品，實驗室可嘗試自建。質控品的選擇和構建首先需注意與臨床患者標本的模擬度，同時保證組份穩定且均一，數量充足，便于長時間分析：(1)質控品配制：建議由經驗豐富的專業人員在專門區域進行構建、配制和分裝，切勿在臨床標本操作區域。自建質控品要求采用高靈敏的檢測方法進行評價；(2)質控要求：對于定性檢測項目，建議運行弱陽性、陰性質控品以及空白對照；對于定量檢測項目，建議運行定值、陰性質控品以及空白對照。考慮到每個檢測平臺的實際成本和臨床可操作性，實驗室可自行規定質控頻率和質控覆蓋位點；(3)質控規則：無論是商品化或自建質控品，實驗室需建立質控的可接受標準。定量檢測項目建議使用質控圖和設定的質控規則。

2．質間質評：

(1)室間質量評價(extemal quality assessment, EQA)：通過參加國內外相關的EQA評價實驗室檢測能力，分析和總結能力比對的結果，關注評價結果的趨勢或改變；(2)其他評價方式：對于無室間質量評價計劃的檢測項目，建議與外部實驗室相同或相近的方法比對。

3．NGS檢測平臺的重要參數：

(1)文庫質量：構建的文庫在上機測序前需進行質量分析，應設定每個檢測項目的文庫質量要求，明確接受或拒絕的標準；(2)測序芯片：測序時根據檢測標本量和質量要求選擇合適的芯片，以保證測序質量和靶區覆蓋深度；(3)生物信息分析質量指標：單堿基質量、堿基質量中位數、重復reads百分比、包含接頭序列的reads數量、回貼reads百分比、目標區域reads百分比、目標區域的平均深度、目標區域測序均一度。

(四)分析后質量管理

分析后質量管理涉及多方面因素，需聯合生物信息學、分子生物學、遺傳學和臨床醫學專業背景的多人合作完成報告簽發和臨床解釋。

液體活檢質量管理：

共識15質量管理體系構建應嚴格參照CNAS－CL36：2012文件的要求設定相應質量控制程序并驗證，以達到預期的結果質量。

共識16　質控品應按實際需求綜合考量，選擇最合適的質控品。

共識17　質控管理實施應貫穿檢測整個過程(分析前、分析中、分析后)。

五、數據分析與檢測報告注釋

(一)液體活檢報告注釋

依據檢測靶標和技術的不同，液體活檢的報告內容也有所差異，但原則上檢測報告一般應體現以下內容：(1)檢測名稱，如xx腫瘤xx基因變異檢測報告；xx腫瘤CTC檢測報告等；(2)患者基本信息：姓名、性別、年齡、住院號、送檢科室及醫生等；(3)標本基本信息：標本類型(血漿、胸腹水、腦脊液、尿液等)、標本性狀(是否存在凝塊、溶血、脂血等)、采樣時間、收樣時間、送檢日期和報告日期；(4)病理診斷信息：腫瘤組織類型、TNM分期等；(5)檢測方法和平臺以及其重要的參數說明；(6)檢測結果和cut－off值(基于檢測技術的性能或臨床建議)；(7)臨床意義解讀：臨床意義解讀應客觀平實地描述，對于疾病相關性只描述既往研究中的療效或預測，不能出現使用何種治療手段或策略的語言，同時報告中應附上相關的權威指南、參考文獻、專業數據庫和分析工具網址；(8)備注：若檢測項目、方法、平臺和結果等存在局限性，建議在報告中明確指出，避免不必要的診療誤差；(9)若檢測失敗，應闡述檢測失敗的原因；(10)最終報告應由報告檢測者、制定審核者和報告簽發人聯合審定簽發。

(二)檢測報告解讀

液體活檢的報告解讀建議實驗室人員和臨床醫生共同完成，報告解釋應綜合考慮：(1)患者基本狀態：標本采集前的治療情況、標本采集與治療時間間隔、是否存在嚴重炎癥等；(2)疾病基本狀態：分子病理結果、腫瘤組織類型和分期、進展情況等；(3)檢測方法和平臺的特征，包括檢測敏感度和特異性以及檢測過程中的影響因素等；(4)檢測結果評判標準，如非典型腫瘤細胞和循環腫瘤微栓的判斷和報告；數字PCR檢測過程中陽性液滴的設門和空白限的設定；生物信息分析過程中對特殊標本測序數據的過濾和軟件參數的調整。

數據分析與檢測報告注釋：

共識18　檢測報告中除了患者與標本基本信息外，還應納入檢測體系信息與臨床意義。

共識19　液體活檢的報告解讀建議實驗室人員和臨床醫生共同完成，報告解釋應綜合考慮多方面信息。

展 望

液體活檢技術正以前所未有的速度向前發展。隨著分子生物學技術的不斷革新，液體活檢檢測的靈敏度與特異性也不斷提高，使其成為未來對抗腫瘤的一大"利器"。未來液體活檢發展將集中于三個方面：(1)新臨床應用拓展，例如CTC體外培養聯合藥敏篩選個體化治療藥物、獲得的CTC進一步用于各種方法(如ARMS、FISH、NGS等)檢測腫瘤基因突變、ctDNA克隆進化分析揭示化療獲得性耐藥機制、以及液體活檢技術指導生物免疫治療；(2)新的檢測靶標發掘，外泌體、血小板以及循環非編碼RNA已經展現出巨大臨床應用潛能，有待更加深入系統的研究證實其價值；(3)新檢測技術開發與轉化應用，包括單細胞測序、質譜技術、微流控芯片及多普勒光譜等尖端技術正逐步走出基礎研究實驗室，進入臨床實驗室，依賴這些技術將切實提高液體活檢的質量。

我們應從檢驗醫學的角度出發，立足于"準確性"與"臨床有效性"這兩個關鍵點，對液體活檢項目的檢驗性能與臨床意義進行系統評估，為指導臨床精準診療提供充分的理論基礎與轉化依據。我們需要不斷總結經驗，不斷提高認識，進一步加強規范，提高檢測質量，積極推進液體活檢的發展，助力腫瘤精準診療。