簡介
免疫細胞是一組不均一的細胞群體。各種特定的細胞群其細胞表面表達有各自特異的表面標志分子，利用這些特異的表面標志，可以鑒定、分離和純化相應的細胞群。隨著單克隆抗體技術的誕生和免疫標記技術（特別是熒光標記技術）的發展，以及計算機科學的應用，使利用儀器的方法檢測特異的細胞膜表面分子成為可能。本章介紹的熒光激活細胞分類技術就是采用單克隆抗體技術和免疫熒光標記技術，并結合光學檢測和計算機分析技術而產生的鑒定和分離特定細胞亞群的技術。
原理
流式細胞儀（flowcytometer）是一種能夠探測和計數以單細胞液體流形式穿過激光束的細胞檢測裝置，由于在檢測中使用的細胞標志示蹤物質為熒光標記物，因此，用來分離、鑒定細胞的流式細胞儀有被稱為熒光激活細胞分類儀（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS），是分離和鑒定細胞群及亞群的一種強而有力的應用工具。
其原理是在一組混合的細胞群中，加入特異的針對特定靶細胞表面分子的熒光標記單克隆抗體，這種特異單克隆抗體與其對應的抗原靶分子結合，結合后的熒光標記抗體停留在特定細胞的表面，稱為熒光抗體標記的靶細胞；將含有被標記細胞的混合細胞群混懸在一定容積的上樣緩沖液中，再通過FACS的進樣吸管孔，儀器就會將細胞懸液制成以單細胞排列的微細流束。
當每一個細胞通過儀器的激光束照射時，帶在細胞上的熒光就會被相應的激光束激活并發出對應的熒光，通過敏感的光電倍增管即可檢測到從細胞表面發出的熒光。根據測得的散射光（scatteredlight）可得到細胞大小及顆粒狀態的信息；而從熒光的發射強度（fluorescenceemissions）則提供了結合在細胞上的抗體信息，進而也被反映了該細胞表面相應分子的表達情況。
在流式細胞儀分離裝置中，返回到計算機的信號，可用來產生一種電荷，這種電荷以特定準確的時間通過FACS的吸管孔，在與吸管孔的液體流相相遇時，可將液體流打碎成只含一個細胞的微滴。含有電荷的微滴就會從主液體流中偏移，穿過一雙極板。帶正電荷的微滴被吸引至陰極，而帶負電荷的被吸引至陽極。以這種方式，特定的細胞亞群由于標記著不同的熒光抗體而帶有不同的電荷，從而將目的細胞從混合的細胞群中分揀出來。
應用
流式細胞儀主要有兩個最基本的用途：第一是可以定量分析鑒定活細胞表面表達的特異分子，第二是進行特定的活細胞群的分離和純化。
1. 免疫細胞群的分類靜止淋巴細胞之間從其外觀形態難以區分，都是以致密的核及少量細胞質組成的小而圓的細胞為特征。然而，這些細胞確是由功能各異的不同細胞亞群所組成，各種細胞群表達各自特殊的表面分子。例如，B淋巴細胞上表達有特異的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴細胞表面表達特異的CD3分子。T淋巴細胞又可進一步按其表達的不同表面標志細分成不同的亞群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亞群。因此，可由這些特征性的表面標志，將細胞分為不同的群或亞群。
2. 免疫細胞的分化發育免疫細胞分化發育的不同階段，其表面標志也在不斷地發生著變化。如胸腺細胞（發育過程中的T淋巴細胞），在發育的不同階段從不成熟到成熟，其表面標志經歷了從雙陰性（CD4-CD8-）到雙陽性（CD4-CD8-），直到單陽性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的過程。正常生理狀態下，發育不同階段的胸腺細胞以一定的比例存在于胸腺中。通過檢測這些標志，即可判定某些因素（基因突變等）對胸腺細胞發育的影響。
3. 免疫細胞的分子表達免疫細胞的不同因素的影響下，其表達的分子也會發生變化。通過檢測這些分子的變化，可分析細胞功能以及細胞分化狀態等。例如，靜止的T淋巴細胞不表達或低水平表達CD69分子；而一經活化，其表達CD69分子數量明顯增加。因此，可通過檢測這些活化標志的變化來判定細胞狀態以及研究影響細胞活化狀態的因素。
4. 免疫細胞的分離如前所述，免疫細胞是一組極不均一的群體。所以在研究免疫細胞功能時，常常需要把某些特異的細胞分離和純化。雖然免疫細胞分離的方法很多，但用FACS來純化特定的細胞群是目前最為有效和方便的手段。例如，最近頗受關注的CD4+CD25+T淋巴細胞是一群具有免疫調節（免疫抑制）功能的細胞群。在對其特點及功能進行研究時，首要的問題是分離該細胞群。用相應的單克隆抗體與其結合，再用FACS進行分離，就能得到純度很高CD4+CD25+T淋巴細胞細胞群。而其他分離方法不僅分離過程煩瑣，也很難控制無菌條件及保證細胞純度。
應用舉例
1. 小鼠胸腺細胞CD4及CD8分子表達的檢測
（1）簡要說明
①細胞為小鼠胸腺細胞。
②抗體為PE標記的抗CD4抗體和FITC標記的抗CD8抗體。
（2）結果以點狀二維圖（dotplot）表示。橫坐標為CD8分子，縱坐標為CD4分子。所以右上代表雙陽性細胞群，左下代表雙陰性細胞群，左上代表CD4+CD8-的單陽性細胞群，右下代表CD4-CD8+單陽性細胞群。
（3）結果分析胸腺中存在著發育不同階段的胸腺細胞，這些發育不同階段的胸腺細胞表達CD4及CD8分子存在著差異。上面的結果是正常小鼠胸腺細胞CD4及CD8分子的表達情況：
①存在著4種亞群：CD4-CD8-的雙陰性細胞群（5.6%），CD4+CD8+的雙陽性細胞群（74.3%），CD4+CD8-的單陽性細胞群（16.1%）和CD4-CD8+的單陽性細胞群（4.0%）。
②在這4種亞群中以CD4+CD8+的雙陽性細胞群為主（75%）。
2. 小鼠脾細胞中T細胞和B細胞的組成
（1）簡要說明
①細胞為小鼠脾細胞
②抗體為PE標記的抗CD3抗體和FITC標記的抗CD45R抗體
（2）結果以點狀二維圖表示。橫坐標為B220分子，縱坐標為CD3分子。因此，左上為T細胞群，右下為B細胞群。
（3）結果分析在脾臟中主要存在有兩大類淋巴細胞群—T細胞和B細胞。其中B細胞占60%左右，T細胞占30%。
3. 活化T細胞CD69分子的表達
（1）簡要說明
①成熟T細胞來自正常小鼠脾臟，經純化而獲得，通常情況下T細胞處于靜止狀態，而在不同濃度的抗CD3抗體的刺激下T細胞活化。
②抗體為FITC標記的抗CD69抗體。
（2）結果以直方圖表示。橫坐標為熒光的強度，縱坐標為具有相應熒光強度的細胞數。
（3）結果分析在沒有抗CD3抗體刺激時，絕大多數處于靜止狀態的T細胞不表達CD69分子（CD69+0.3%）；在2 μg/ml 抗CD3抗體刺激下，42.4%的T細胞表達CD69分子；在10 μg/ml 抗CD3抗體刺激下，54.3%的T細胞表達CD69分子。說明靜止的T細胞不表達或表達較少的CD69分子，而活化的T細胞則表達高水平的CD69分子，并且該分子的表達隨著活化的強度而增加。因此，檢測CD69分子可作為T細胞活化的標志。
關鍵點
1. 減少非特異熒光染色
細胞的活性和狀態：流式細胞儀不但可探測細胞表面的熒光，也可探測細胞內的熒光。因此，如果要檢測細胞表面的分子，一定要保證細胞的活性，還應盡可能保持細胞靜止，通常在4度進行操作。否則，熒光抗體進入死細胞內，會產生非特異結果。
封閉抗體的應用是必不可少的，因為大多數的免疫細胞表面都表達有Fc-R。細胞與抗體相互作用后，一定要用FACS緩沖液洗2~3次，以除去游離的抗體。
2. 單染色時以FACS最常用，FITC標記抗體熒光比較穩定而且價格合適。
3. 如果同時要檢測兩種以上的分子，一定要選擇不同波長的熒光所標記的抗體。