畢赤酵母PEG1000轉化方法

實驗概要

本文介紹了畢赤酵母PEG1000轉化方法。據稱PEG比LiCl 方法好，但不如去壁細胞及電轉化法，但對沒有電轉裝置的人來說，更方便，效率為10²-10³/ugDNA。

主要試劑

Buffer A：1M山梨醇，10mM bicine(N－二(羥乙基)甘氨酸)pH8.35，3%(v/v)乙二醇

Buffer B：40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N－二(羥乙基)甘氨酸pH8.35

Buffer C：0.15M NaCl，10mM N－二(羥乙基)甘氨酸pH8.35

過濾除菌，存于-20 度

新鮮的試劑級DMSO，未打開或剛配制，存于-70 度直至使用。

實驗步驟

1. 感受態細胞制備：

   1) 在YPD 平板上劃線培養畢赤酵母菌，30 度孵育2天。

   2) 從平板上挑取單克隆于10mlYPD 中，30度振蕩過夜。

   3) 早上，在100mlYPD 培養基中接種等量的過夜培養物，至OD600 達0.1，在30 度生長至OD600 為0.5-0.8。

   4) 室溫3000g離心收集細胞，用50ml Buffer A洗滌細胞1 次。

   5) 用4ml Buffer A重懸細胞，分成0.2ml 等份分裝至1.5ml離心管中，加11ulDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷凍細胞。

   6) 存于-70度。

2. 轉化：

   1) 在<20ul 水中加入50ug DNA，將DNA 直接加入仍處于冰凍狀態的感受態細胞管中。載體DNA(40ug 變性及超聲處理的鮭魚精DNA)中加入＜1ug DNA 樣品，檢測最大轉化效率。

   2) 在37 度水浴中孵育各管5min，其間混勻1-2 次。

   3) 取出各管，加入1.5ml Buffer B，完全混勻。

   4) 在30 度水浴中孵育1 小時。

   5) 室溫，2000g 離心樣品10min，去除上清，用1.5ml Buffer C 重懸細胞。

   6) 再次離心，用0.2ml Buffer C 重懸細胞。

   7) 將管中內容物全部涂在選擇生長平板上，30 度孵育3-4 天，篩選Mut 表型，或篩選遺傳霉素高抗性克隆。

注意事項

注意，當細胞溶解后，即使放在冰上，其感受性下降都極快，加入DNA于冰凍的管中很關鍵。可進行多個轉化，建議每次轉化6個。