近代質粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表,鑒于大腸桿菌(E.coli)在分子生物學研究中的重要地位,從大腸桿菌(E.coli)中分離純化質粒DNA(Plasmid DNA)成為超離心技術中一個重要課題。而質粒DNA的快速分離純化又對超離心設備(超速離心機、轉頭和附屬設備)提出了更高要求。
針對E.coli的顯微結構待點,在進行超離心分離純化質粒DNA之前的預處理順序是:
沉淀物可以在加入TE緩沖液(10mM Tris-HCL, lmM EDTA,pH8.0)后,采用分子篩技術去除蛋白和RNA; 也可以用超速離心法去除蛋白質和RNA,去線狀DNA或DNA斷片。
質粒DNA超速離心的分離方法
傳統的分離方法:數年前,由于受設備條件限制,質粒DNA的分離一般用CsCl平衡等密度離心法,自形成梯度。以10~12ml單管容量為例,用甩平轉頭分離,36.000rpm×60小時,用角式轉頭分離45,000rpm×36小時,前者包括加減速在內共用去1.3億轉驅動部壽命,后者也要用去1億轉驅動部壽命,這對當時超速離心機總壽命為100~200億轉來看,無疑每次實驗費用過高,加上CsCl用量多、價格貴等因素,使這類分離純化工作成為非常昂貴的實驗。