植物總DNA提取
植物總 DNA 的提取有多種方法,轉基因食品檢測中不同用途的 DNA 提取應該采用各自適宜的方法進行。下面介紹用于新鮮或干燥的植物性食品檢測的常見 DNA 提取方法。
1、可用于 PCR 的粗提液微量制備
1)原理與特點
利用攪拌破碎食品組織,堿液破壞細胞壁然后再用緩沖液進行提取。此法主要用于用 PCR大量快速檢測轉基因材料。
2)試劑
0.5mol/L NaOH, 100mmol/L Tris(pH8.0)。
3)方法
(1)稱取5～10mg 檢測材料,置 Eppendorf 管中,加入5～100μL NaOH,用玻璃棒搗碎,靜置片刻。
(2)取 5μL 上清液轉入另一個 Eppendorf 管中,加入 Tris 緩沖液至50～500μL,備用。
2、SDS 法提取植物性食品中的 DNA
1)所用試劑
提取緩沖液:100mmol/L Tris·Cl( pH8.0);50mmol/L EDTA( pH8.0); 500mmol/L NaCl,10mmol/L α-巰基乙醇,10%或20%SDS,5mol/L KAc。
2)方法
(1)簡易大量粗提取 DNA
①取 25mL 的離心管,加入15mL 提取緩沖液,1mL 10%SDS,混勻,于65℃預熱。
②取檢測材料4g,置液氮中研磨成粉。
③將凍粉轉入上述離心管中,混勻,65℃保溫20min,其間搖動1～2次。
④向離心管中加入5mL 5mol/L KAc,混勻,置冰浴中30min。
⑤4℃、12000r/min 離心10min,上清液轉入另一離心管中。
⑥加入5mL 氯仿/異戊醇,顛倒離心管混勻,12000r/min 離心5min。
⑦取上清液,加入2/3體積的異丙醇,顛倒離心管混勻,靜置至出現絮狀物。
⑧挑出絮狀物置離心管中,加入適量70%乙醇,輕搖離心管,離心,去上清液,再加入70%乙醇,重復操作2～3次。
⑨沉淀吹干,TE 溶解,備用。
⑩說明:如果對蛋白質雜質要求不高,可省略操作⑥;此法制備的 DNA 可用于 PCR。
(2)小(微)量提取 DNA 及純化方法
操作:括號內為微量提取時的試劑用量。
①取0.8～1.2g(50～200mg)新鮮植物組織,置液氮中研磨成粉。
②將凍粉大致平均分配到兩個15mL(1.5L)的離心管中,各加入提取緩沖液7mL(900μL),輕輕攪動,使粉末充分散開。
③各加入1mL(100L)10%ss,充分混勻,于65℃水浴中保溫10～15min(間隔晃動2～3次)。
④各加入1.85mL(160μL)5mol/L KAc,充分混勻,冰浴中放置30min。4℃、12000r/min 離心 15min。
⑤上清液轉入新離心管中,加入等體積的氯仿異戊醇,輕輕顛倒離心管數次,放置片刻。4℃、8000r/min 離心 10min。
⑥上清液轉入另一離心管中,加入2/3倍體積一20℃預冷的異丙醇,混勻,放置30min,觀察 DNA 沉淀生成。
⑦于4℃、8000r/min 離心 10min,倒去上清液將離心管倒置于吸水紙上,控干上清液。
⑧用80%的乙醇洗滌沉淀,吹干10～15min。
⑨加入500μL(100μL)TE緩沖液充分溶解沉淀(若溶解不好,可置37℃水浴中保溫,促進溶解)。將溶液轉入 Eppendorf 管中,加入1μL RNase 酶液,于37℃保溫 1h。
⑩加入等體積酚/氯仿,混勻,室溫放置10mi,4℃、8000r/min 離心 5min。將上清液轉移到新的離心管中,重復此操作。
?轉移上清液于新離心管中,加入等體積的氯仿/異戊醇,輕緩倒管混勻,室溫放置幾1分鐘后,10000r/min 離心 5min。
?轉移并量出上清液體積,置新離心管中,加入3mol/L NaAc,使其終濃度為0.3mol/L(也可以加終濃度為0.2mol/L NaCl 或終濃度為 2.5mol/L 的乙酸銨),混勻,加入2倍體積的無水乙醇,輕緩混勻,室溫放置數分鐘。10000r/min 離心5～10min,按⑦操作,去盡上清液。用80%乙醇洗滌沉淀2～3次吹干。
④加入50μL(10μL)TE 或蒸餾水溶解 DNA,備用。
注:a.該方法制備的 DNA 可用于限制性酶切、Southern 雜交、RAPD 分析等;
b.用于禾谷類作物總 DNA 提取時,在粗提物用TE溶解后改用低速離心數分鐘,去除污染物后加入終濃度為 0.3mol/L 的 NaAc(pH5.2)及0.6倍體積的異丙醇,再次沉淀 DNA,然后用80%的乙醇洗沉淀,吹干,產率可達40～120μg/g 鮮重.所提取的 DNA 可被限制性內切酶消化,但酶切消化時,需加大酶量并反應3～4h;
c.對于馬鈴薯、番茄等富含多酚類物質的材料,提取緩沖液中Tris的濃度可以減半巰基乙醇的含量應提高。操作中在加入提取緩沖液后需增加在冰冷的條件下加入20% PVP 至終濃度為6%,PVP 能與多酚類物質結合,經離心后除去。SDS的用量應提高,可加入20% SDS至終濃度為2%。