核型分析

實驗概要

核型分析

實驗原理

因為染色體在細胞周期分裂期的前期開始凝集，所以對阻滯于有絲分裂中期的細胞進行核型檢測，這時的染色體已完成凝集，形態上容易辨認。秋水仙素可以破壞微管裝配，使紡錘體不能形成，使大量細胞停止在分裂中期；低滲作用使水進入細胞內，細胞內空間變大，染色體間的距離拉大，易于染色體展開；固定液使蛋白質變性，染色體內的組蛋白變性后硬度增加，有利于染色體形態的保持，細胞膜蛋白變性使細胞膜硬度增強，形成屏障作用，防止了細胞內物質外溢和丟失。

主要試劑

20 μg/mL秋水仙素、0.56% KCl(w/v)、核型固定液、核型用磷酸緩沖液、Giemsa染液

實驗材料

15 mL離心管、移液管、載玻片、染色盒、核型分析儀

實驗步驟

①在細胞培養液中按1∶200加入20 μg/mL秋水仙素至終濃度為0.1 μg/mL，細胞正常培養條件下處理2～4 h。
注意：細胞在分裂間期染色質凝集，為了方便檢測核型，需要使細胞處于分裂間期。秋水仙素可以使細胞停滯于有絲分裂中期，但并不是阻滯時間越長越好，一般2～4 h為宜。
②將0.1 M KCL低滲液預熱至37℃。
③取出培養瓶/皿，加入0.25%胰蛋白酶將細胞消化成單細胞懸液。
④將細胞懸液轉移至15 mL離心管，1000 r/min室溫離心10 min，棄上清。細胞沉淀中加入4 mL事先預熱至37℃的0.1 M KCl低滲液，用滴管吹打成單細胞懸液，37℃低滲處理15～20 min。
注意：低滲處理非常關鍵。低滲處理不充分，細胞膨脹不充分，影響最后染色體的平鋪;低滲處理時間過長，會使細胞提前破裂，使溶液中存在散在的染色體。
⑤配10 mL核型固定液，4℃冰箱預冷。
⑥加入1 mL預冷的核型固定液，輕輕吹勻（用滴管從上到下吹吸10次）后1000 r/min 4℃離心10 min。
⑦棄上清，加4 mL新鮮預冷的核型固定液（一個3.5 cm培養皿的細胞加4 mL核型固定液），輕輕吹打成單細胞懸液，放入4℃冰箱固定30 min以上。
⑧4℃ 1000 r/min離心10 min。
⑨配8 mL的核型固定液，4℃冰箱預冷。
⑩重復第⑦、⑧步兩次。
?棄上清，加入少量核型固定液（0.2～0.6 mL）重懸細胞。
?取一潔凈載玻片，用滴管吸取細胞懸液，于載玻片垂直上方50 cm以上處滴片，將載玻片傾斜放置，自然晾干（1 h以上）。
?配10 mL Giemsa染液。
?將載玻片倒扣（染色體面向下）于染色盒內，于載玻片和盒內壁之間加入染液，室溫染色1 h（如果染色程度不夠，可加入新鮮配制的染液再染1 h）。
?將載玻片取出，于自來水中沖洗0.5～1 min，再用蒸餾水沖洗5 s，自然晾干。
?顯微鏡下觀察、計數。每個核型數3次，載玻片沿前后方向移動，再沿左右方向換視野，左右兩視野間要有1/2重疊。每個樣品要數50個以上核型。