參加PCR反應的物質為模板、引物、耐熱DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸和鎂離子，其中關鍵步驟是最佳引物的設計 [2] 。
1. 模板核酸
模板(靶基因或樣品DNA)核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環節之一。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。DNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解RNA。
2. 引物
PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈作引物。每條引物鏈的濃度為0.1~1μmol或10-100pmol，以反應所需要的最低引物量的濃度為好。
3. DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶基因全長2496個堿基，75~80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷酸，在PCR循環的高溫條件下仍能保持較高的活性和良好的熱穩定性，溫度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性。目前，有兩種TaqDNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。
4. 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)
dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。在PCR反應中，dNTP應為50-200μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，濃度過低又會降低PCR產物的產量。
5. 鎂離子濃度
Mg2+能與dNTP結合，Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為20μmol/L時，Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜，Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增：濃度過低，會降低taqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。