旋轉瓶培養

實驗方法原理 將細胞懸液加入到圓形培養瓶中，然后將培養瓶放在旋轉架上緩慢轉動。

實驗材料 D-PBSA0.25%天然胰蛋白酶單層細胞二氧化碳

儀器、耗材 培養液和培養液容器旋轉培養瓶血細胞計數板或電子細胞計數器和計數用液體旋轉架

實驗步驟

1. 用胰蛋白酶消化細胞，以通常密度種植。

旋轉瓶中的氣相較大， 故用基于 Hanks 鹽和空氣氣相的培養基，可能需要向培養瓶內充入少量 5% CO2 （如 10 L/min，2 s）。如果培養液是用 CO2/HCO3 緩沖的， 氣相應該用 5% CO2 調整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小決定）。

2. 將培養瓶放在旋轉架上，以 20 rph 的速度轉動，直至細胞貼壁（24~48 h ) 。

3. 細胞密度增大時，加快旋轉速度至 60~80 rph。

4. 給細胞加培養液或收集培養液時，可將培養瓶取到無菌工作區，如通常一樣排出培養液，然后更換新鮮培養液。假如體積不是關鍵問題，輸血裝置或培養液袋對于添加新鮮培養液是有用的。如果培養液容量至關重要，可用吸管滴加或用一個蠕動泵計量。

5. 收獲細胞：

(a)棄去培養液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗細胞，然后棄去 D-PBSA。

(b)在 4°C 條件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋轉架上以 20 rpm 將培養瓶轉動 15 s。

(c)吸出胰蛋白酶，將培養瓶內的細胞消化 5~15 min，然后加入培養液。

(d)搖晃和轉動培養瓶，用滴管將細胞洗出。