摘要
RT－PCR 已經成為研究者確定感興趣的器官、組織或細胞中mRNA 轉錄本出現、結構和表達水平的基本方法。RT－PCR的基本步驟包括：首先對樣品中出現的所有mRNA 合成一個cDNA拷貝，接著擴增感興趣的基因。因為兩個步驟中使用的反應緩沖液不能兼容，所以這兩個步驟（RT 和PCR）通常分別進行。即使有些試劑盒能將兩個步驟合而為一，但是同樣因為上述的緩沖液不兼容性，極大地限制了檢測靈敏度。Eppendorf 設計了一個含有全新化學物質的新試劑盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在兩步法實驗中可以獲得更高的靈敏度。本文將對新試劑盒的表現進行檢驗。
簡介
逆轉錄（RT）以及隨后進行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得最廣泛的技術之一。如果需要平行分析多個RNA 樣品，首選方法為一步法RT－PCR。如果要擴增困難目標片段或從單一cDNA 池中擴增多重目標片段則會選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統適用于各種RT－PCR 應用。它含有一種全新的重組逆轉錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應緩沖液能夠自動調節鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無需優化。這種自我調節的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實現的。如果鎂離子濃度過高，螯合劑會與過剩的鎂離子結合，如果反應（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會被釋放出來。這種創新技術提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進行一步法，又能進行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動力學檢測范圍，能擴增得到的PCR產物長度范圍也很大（一步法反應最長可擴增5.3 kb片段；兩步法方案最長能擴增12.3 kb 片段）。
下面的實驗可以展示該試劑盒在不同應用中的表現。
實驗1關注新試劑盒在一步法RT－PCR 中卓越的靈敏度。而在一步法應用中，最重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標材料進行有效工作。
實驗2顯示應用一步法方案進行長距離RT－PCR 不再是個難題。試劑盒中創新的緩沖液能同時保證逆轉錄酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。
本系統提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實驗3描述了對不同模板的擴增情況。這個新的系統能為所有的RT目標提供全面解決方案，不論需要擴增的片段是中等長度還是極長，不同來源的總RNA 中轉錄本是低豐度還是高豐度。
材料和方法
Eppendorf cMaster RTplusPCR系統
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應均在Eppendorf Mastercycler? gradient梯度PCR儀上進行。
實驗1：一步法靈敏度檢測RT－PCR
擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA：從人HELA細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統，標準一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應總體積50μl
循環參數：
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 50°C | 30分鐘 | 逆轉錄 |
| 1x | 2 | 94°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 40x { | 3 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 4 | 68°C | 45秒 | 引物退火/延伸 |
cMaster RTplusPCR 系統顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。
實驗2：一步法擴增長片段RT－PCR
擴增目標：5.3 kb 的人結節性腦硬化因子（hTSF）mRNA 片段。
模板RNA：從人HELA 細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度為100 ng 和10 ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。
設置一步法RT－PCR 反應。
| 成分 | 50μl RT－PCR反應體積 | 反應成分的終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 2.5μl | |
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 2.5μl | 500μM |
| hTSF正向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| hTSF反向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| 總HELA RNA | 3.0μl | 每個反應中中含10ng－100ng |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 34.0μl | |
| 含鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液 | 5.0μl | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| cMaster RT 酶 | 0.5μl | 0.15U /μl |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.5μl | 0.05U /μl |
| MasterMix 2 | 40.0μl |
循環程序參數
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 65°C | 5分鐘 | 初始RNA變性 |
| 1x | 2 | 42°C | 60分鐘 | 逆轉錄 |
| 1x | 3 | 93°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 35x { | 4 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 5 | 59°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 6 | 68°C | 5.5分鐘 | 引物退火 |
如圖2 所示，應用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產物。這個PCR 反應非常困難，大多數RT－PCR 試劑盒生產廠家從未發布過應用一步法方案，有效擴增類似長度模板的結果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩定可靠地從10 ng HELA 細胞RNA 中擴增該產物。
實驗3：兩步法RT－PCR
兩步法RT－PCR 的擴增目標：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA 片段
1.3kb 的（鼠和人）腫瘤壞死因子受體（TNFR1）mRNA 片段
5.3 kb 的人結節性腦硬化因子（hTSF）mRNA 片段
12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA 片段
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉錄反應均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物為引物。
設置第一步RT 反應
| 成分 | 以Oligo（dT）20 為引物進行逆轉錄 | 反應成分的終濃度 | |||||||
| 不含RNA 酶的水 | 加至MasterMix 1 總體積為10μl | ||||||||
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 1.0μl | 1mM | |||||||
| Oligo（dT）20 引物（0.5μg /μl） | 1.0μl | 25ng/μl | |||||||
| 模版RNA | |||||||||
| HELA (350ng/μl) | 3.0μl |
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