抗磷酸肽的單克隆抗體制備實驗

融合后的候選雜交瘤細胞系BSA 交聯的同種磷酸肽BSA 交聯的同種非磷酸肽BSA 交聯的非同種磷酸酪氨酸肽BSA 交聯的同源磷酸肽

篩選稀釋液陰性對照（用于制備雜交瘤系的小鼠的免疫前血清）陽性對照（用于制備雜交瘤系的小鼠的免疫后血清）

HT 培養基96 孔聚苯乙烯組織培養板網格標記的紙片

1. 將融合后的雜交瘤細胞以低密度（最好是每三個孔有一個細胞）接種到多個 96 孔聚苯乙烯組織培養板中，培養于 HT 培養基中。約 2 周后用 96 格-網格紙片記錄克隆數以檢查并鑒定出所有的單克隆雜交瘤細胞培養孔。在含有一個克隆的孔下做上標記以便于鑒別。

2. 采用無菌技術從每個潛在的候選孔中吸取部分上清（如從 200 μl 培養液中吸取 100 μl 轉移到另一 96 孔聚苯乙烯板（「篩選平板」）中。記錄初始培養板的編號和孔的位置以及相應的篩選平板的平板編號和孔的位置（如在代表篩選平板的網格紙片上記錄上清液來源的初始平板的編號和孔的位置）。往初始培養板的每個孔中補加 100 μl 37℃ 的新鮮 HT 培養基。

3. 往篩選平板各孔的上清液中加入 150 μl 篩選稀釋液。

4. 從篩選平板的每個候選雜交瘤上清液中取一小份（如 50 μl），以同種磷酸肽-BSA 交聯物為抗原用 ELISA進行篩選。記錄每個陽性樣品所對應的篩選平板編號和孔的位置，以及相應的初始培養板的編號及孔的位置。同時檢測用于融合的小鼠的免疫前血清（陰性對照）和免疫后血清（陽性對照），將兩種血清按照 1:100 稀釋于 HT 培養基與篩選稀釋液的混合液（1:1）中，然后再進行測量。再包含一個僅含篩選稀釋液（額外的陰性對照）的 ELISA。

5. 從步驟 4 中篩選出的陽性樣品中取一小份針對同種非磷酸肽- BSA 交聯物進行 ELISA 篩選以去除具有不依賴磷酸化反應性的克隆。取一份針對非相關的磷酸酪氨酸肽-BSA 交聯物進行 ELISA 篩選以去除對磷酸酪氨酸沒有選擇性而都能發生反應的克隆。此外，如果預測能與同源磷酸蛋白質有交叉反應，還要進行針對任何可能有交叉反應的同源磷酸蛋白質-BSA 交聯物的 ELISA 篩選。

6. 將滿足所有篩選條件的克隆進行擴增，分裝并部分凍存，其余的通過有限稀釋進行亞克隆。

7. 按照步驟 4 和 5 的方法對亞克隆的培養上清液進行篩選以檢測抗體的持續產生及其特異性。

8. 為了進一步對亞克隆進行定性并鑒定出最有用的克隆，用各種免疫檢測方法（如免疫沉淀法或免疫印跡分析法）測試培養上清液對同種全磷酸蛋白質的反應性。

所有會與活細胞接觸的溶液和設備都必須是無菌的，并且應當采用正確的無菌操作技術。