2．核酸的分離純化 從細胞中提取核酸后，仍混雜著蛋白質、多糖和各種大小分子核酸同類物。除去這些“雜質”的過程，也就是核酸提純過程。在核酸的分離純化時，為防止核酸大分子的變性降解，必須在0～4℃的低溫條件下操作。核酸酶的水解作用，是過去制備具有活性核酸大分子的嚴重障礙，現普遍采用加入去污劑或加入EDTA、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉以除去核酸酶的激活劑Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保證在提純過程中核酸大分子的完整。關于核酸分離純化階段中除去多糖、蛋白質及不同類型核酸之間分離的一些方法，分別介紹如下：
（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學性質與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數天然后殺死，可使細胞內肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。
（2）蛋白質的除去：由于核酸在細胞內以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進入水相，蛋白質則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。
（3）不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經常發生的。由于DNA和RNA結構和性質都很相似，而且分子量都十分大，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復雜和繁瑣的一步。從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數分鐘，就可達到破壞RNA的目的。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0.5～1mgDNA溶液中，0～4。C下攪拌1h ，以31000×g離心1h，除去RNA后的DNA回收率可達94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復抽提RNA，可以除去絕大部分DNA。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理，破壞DNA，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去。
（4）同類核酸的分離
①RNA混合物的分離：經過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物。進一步純化時，多應用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度）離心法分開。mRNA的代謝速度較快，在細菌中平均壽命為90min，在哺乳動物中約為幾小時至十幾小時，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進行分離。制備rRNA時，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸處理，使二者分開。各種tRNA的提純，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統下進行，分離效果較好。
②DNA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離，常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。一個具有生物活性高度提純的DNA制品應具有如下標準：不含有蛋白質及多糖；不含有可透析的小分子雜物；在pH7時紫外吸收最大值在257～261μm之間，E（P）在6600左右；不含有RNA；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動雙折射作用；具有電泳均一性及超離心中單分散性；具有生物活性。
（五）抗原的濃縮
濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑（包括水）變為高濃度溶液的過程，在制備生物大分子及各種生化產品時，常在提取后和結晶前進行濃縮，有時也貫穿在整個制備過程中。沉淀（包括鹽析和有機溶劑沉淀），廣義上來說也是一種濃縮方法，經過沉淀再溶解，濃度可大大提高，但有時提取液很稀，體積又很大或結晶前除去少量溶劑，則常用其他方法濃縮。
1．蒸發法 液體在任何溫度下都在蒸發，蒸發是溶液表面的溶劑分子獲得動能脫離液面逸向空間的過程。當溶液受熱，液體中溶劑分子動能增加，蒸發過程加快。蒸發的快慢和溫度、蒸發面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度，即蒸汽壓大小有關。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經常處于不飽和的低壓狀態，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動態平衡狀態，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據上述原理，蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴大液體表面積、低壓和加速空氣流動等因素而設計的。
2．冰凍法 冰凍法也是生物大分子及其他有機化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時，水分結成凍，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中。操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液，用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮于液面，蛋白質和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 是一種通過吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學反應，對生物大分子不起吸附作用，易與溶液分開，吸收劑除去溶劑后能重復使用。實驗室中最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時，首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質能滲入凝膠內，而生物大分子卻完全排除于凝膠之外的，然后將洗凈和干燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中，凝膠親水性強，在水中溶脹時，溶劑及小分子被吸收到凝膠內，生物大分子留下剩余的溶液中，離心或過濾除去凝膠顆粒，即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時吸收水分及小分子物質可同時起到濃縮及分離純化兩種作用，對生物大分子結構和生物活性都沒有影響。是近年來生物化學及分子生物學日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收劑時，需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，扎緊袋口，外加聚乙二醇復蓋，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶劑飽和后，可更換新的，直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以后的聚乙二醇經過加熱除去溶劑便可再次使用。
4．超濾法 超濾法是使用一種特制的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法。當溶液在一定壓力下（外源氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶液和小分子透過，大分子受阻保留于原來溶液中，其原理如圖2—2所示。這一近年發展起來的新方法是適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優點。除去濃縮、脫鹽外，并可應用生物大分子的分離純化，是目前民展較快且為人們所采用的生化技術之一。
圖2-2 超濾法示意圖
通過超濾法，蛋白質和酶的稀溶液一般可濃縮到10%～15%濃度，回收率高達90%。超濾法應用關鍵在于膜選擇。不同類型的規格的膜、水的流速（在規定壓力下以ml/cm2/h或分表示）、分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量數值）等參數均不同，必須根據工作的需要來選用。此外，超濾裝置形式、溶質成分及性質、溶液濃度及粘度都對超濾的效果有一定影響。
制品濃縮到一定程度，即可貯存，如有必要可采用低溫干燥（冰干）的方法除去制品中溶劑，使之成干粉。
制品的貯存可分干態貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存，都要避免長期暴露在空氣中，防止微生物的污染。溫度對生物活性物質的活性影響很大，在絕大多數情況下應采取低溫保存。
干態儲藏：干燥的制品一般比較穩定，如制品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數個月甚至數年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置于干燥器內（內裝有干燥劑）密封，保持0～4℃冰箱中即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶中，每次用時，只取一小瓶。
液態儲藏：液態儲藏的優點是使樣品減去干燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結構破壞較少，缺點是需要較嚴格的防腐措施，儲藏時間不能太長。如樣品量大時封裝運輸不方便，實驗室常采取少量安瓿封存方法。液態儲藏注意事項如下：
樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度后才能封裝儲藏，樣品太稀時容易引起生物大分子變性作用。
一般需加入防腐劑和穩定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質和酶常用的穩定劑有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和輔酶以提高其穩定性，此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對某些酶也具有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標準緩沖液中。
儲藏溫度要求較低，大多數在0℃左右冰箱保存即可，有的則要求更低溫度。但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低溫保存時，有宜使溶液結冰以造成其分子結構被破壞，另也有文獻報道某些蛋白質和酶在低溫中反而引起變性。故應分別情況對待，不能一概而論。
生物大分子和各種生化制品的儲藏和保存，總的來說，溫度和水分是影響穩定性的兩個重要因素，其次是各種穩定劑的應用是否適當關系也很大。實際應用時，必須對各方面都加以考慮。
所提取、純化的抗原物質，在使用前應進行定量測定。定量測定的方法，可根據不同的物質，選擇合適的方法進行。
某些分子量較小的抗原，如肽類半抗原，由于其結構較為簡單，目前已有化學合成的純品供應，不必自己去從組織中提取。化學合成是一項專門技術，可參閱有關書籍。
二、免疫原的制備
用為免疫動物產生抗體的抗原物質如果是人工合成的。質地比較純，免疫動物后可獲得質量好的抗血清。如果以從組織中提取的物質作為抗原，必須經過純化，保證提取物的純凈，才能獲得質量好的抗血清。某些物質的分子量比較小，抗原性弱，屬于半抗原，不易使動物產生抗體，必須把這些半抗原連接到大分子物質（載體）上，形成較為理想的免疫原，既能減少免疫注射的次數，又可節約抗原，產生良好的免疫效應，獲得高質量的抗體。
（一）載體
用為作為載體的物質較多，下列幾類可供選擇。
蛋白質類載體：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、牛甲狀腺球蛋白（TG）、血藍蛋白（Hemocyanin）以及人、牛和雞γ-球蛋白等均可作為載體。這些載體免疫活性較強，有商品供應，容易獲得，即使自選提取，操作也較方便。常用 的有TG、BSA、HAS等，以TG為好。
多肽聚合物，人工合成的多聚賴氨酸 、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等，可與半抗原結合，所形成的免疫原可獲高滴度、高親合度的抗血清。
大分子有機化合物和某些粉末，如聚乙烯吡咯酮、羧甲基纖維素、聚甲基丙酸酯微粒、乳膠和炭末等，可吸附半抗原，也可用來作為載體，但用這類載體合成的免疫原免疫動物，所獲抗血清的質量不穩定。
載體，尤其是大分子物質本身就是一種抗原，它們進行體內，可發揮致敏作用，激活免疫系統，從而使半抗原也可以使機體產生優質的抗體。因此，如果把半抗原與無免疫原性的載體結合，就不能使機體產生抗體。另外，半抗原與載體結合后，可適當延遲其降解和排出體外，從而可以發揮更久的作用。
（二）偶聯劑
半抗原和載體聯接，操作比較簡單，在一般實驗室中都可進行。但對反應條件有一定的要求：在反應過程中半抗原的免疫活性不發生改變，也不應引起載體變性到不溶解的程度。常用的方法是利用偶聯劑把半抗原和載體聯接起來。用作偶聯劑的有碳化二亞胺類、戊二醛、二異氰酸化合物和二鹵化二硝基苯等。這些偶聯劑使半抗原與載體在-COOH、-NH2或-SH等基團部位發生結合。
碳化二亞胺偶聯過程示意如下：
由反應過程可見，碳化二亞胺的偶聯作用即可以在NH2部位發生，也可發生在羧基部位。
戊二醛所起的偶合作用與碳化二亞胺有所不同，戊二醛的兩個醛基分別與載體和半抗原的-NH2結合。它起一種“橋梁”作用，而把載體與半抗原聯接在一起，其反應過程為：
在免疫原的制備中，應根據不同的半抗原選用偶聯劑。
（三）制備過程
以制備催產素（OT）免疫原為例：
（1）1mgOT，溶解于1ml 雙蒸餾水或0.25%醋酸溶液中。10mgTG溶解于1ml 0.1mol/LPBS(pH7.5)或蒸餾水內。
（2）把OT溶液與TG溶液振蕩混勻。
（3）邊攪拌邊滴加入0.25%戊二醛1ml。加畢后再攪拌5～10min，在室溫下繼續反應2～3h，就可供免疫動物用。
免疫原以新制備的為好，如果一次制備了較多的免疫原，也可保存在-40℃的低溫冰箱內備用。