本品在體內經酶轉變為5－氟尿嘧啶脫氧核苷，與胸腺嘧啶核苷合成酶的活性中心形成共價結合，使該酶的活性受到抑制，使胸腺嘧啶核苷生成減少，導致DNA的生物合成受阻；此外，它還可轉變為三磷酸氟尿嘧啶核苷，以偽代謝物形式摻入RNA中，從而干擾RNA的正常生理功能，影響蛋白質的生物合成。近年來研究發現，本品的活性代謝物5－氟尿嘧啶脫氧核苷及甲撐基四氫葉酸可與胸腺嘧啶核苷合成酶形成三聯復合物，阻止胸腺嘧啶核苷合成酶的活性發揮，從而抑制DNA的合成。
本品對增殖細胞有明顯殺滅作用，對S期細胞特別明顯，但它同時又可延緩G1期細胞向S期移行，因而出現自限現象。
毒理研究
遺傳毒性
本品在體外能誘導小鼠胚胎纖維細胞的癌性變，但致癌性與致突變之間的關系尚不明確。盡管本品對TA92、TA98和TA100鼠傷寒沙門氏菌未見致突變作用，但對TA1535、TA1537、TA1538鼠傷寒沙門氏菌和釀酒酵母菌又致突變作用。此外，本品小鼠骨髓微核試驗結果陽性。在體外試驗中，本品高濃度下可引起倉鼠成纖維細胞染色體斷裂。
生殖毒性
大鼠腹腔注射本品125或250mg/kg可引起染色體畸變和精原細胞染色體結構的改變，也能抑制精原細胞的分化，從而導致不育。雌性大鼠在排卵前連續3周每周腹腔注射本品25或50mg/kg，能明顯減少交配的發生，延緩胚胎植入前后的發育，增加植入前的死亡率，并導致胚胎染色體異常。
動物試驗顯示本品具有致畸作用。盡管尚無氟尿嘧啶引起人類畸形的直接證據，但應重視的是，其他DNA合成抑制劑已有導致人類畸形的報道。因此有生育可能的婦女應避免懷孕。如果患者在孕期使用本品或在用藥期間懷孕，應被告知本品對胎兒的潛在危險。只有當本品的潛在益處大于對胚胎的潛在危險時，才可在孕期使用本品。
尚無本品圍產期毒性研究資料，但本品可通過胎盤進入大鼠胎仔的血液循環，導致胚胎的吸收和死亡。尚不清楚本品是否經人乳排泄，鑒于本品可抑制DNA、RNA和蛋白質的合成，母親在使用本品時應停止哺乳。
致癌性
尚無較充分評價本品致癌性的動物長期給藥的試驗資料。大鼠連續52周，每周5天連續經口給予本品0.3、1、3mg/只，隨后觀察6個月，未見致癌作用。雄性大鼠每周1次，連續52周靜脈注射本品33mg/kg，隨后觀察其生命過程，也未見致癌作用。雌性小鼠每周一次，連續16周靜脈注射本品1mg/只，對肺腺癌的發生率無影響。但根據現有資料尚不能對本品的人體致癌性作出評價。