土壤農桿菌LBA4404菌株

YEB液體培養基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸鎂 氯化鈣 利福平儲液

超凈工作臺 恒溫搖床 冷凍高速離心機 高壓滅菌鍋 冰箱 超低溫冰柜 分光光度計 接種針 試管 離心管 離心管 冰浴 微量進樣器 吸頭

一、實驗儀器、材料和試劑

1.  儀器

超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍高速離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進樣器及吸頭。

以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。

2.  材料

土壤農桿菌LBA4404菌株或其它農桿菌菌株

3.  試劑

（1）YEB液體培養基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。

（2）利福平（Rif）儲液：50 mg/ml

（3）20 mM CaCl₂，高壓滅菌。

二、實驗步驟

1.  挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養過夜。

2.  取過夜培養菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養基中，28℃振蕩培養至OD₆₀₀為0.5。

3.  取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。

4、加入1000 μl 20 mM CaCl₂，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30 min。

5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預冷的20 mM CaCl₂，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24 hr內使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存備用。