微生物果膠酶的研究應用

果膠質廣泛存在于高等植物中，是植物細胞胞間層和初生壁的重要組成成分，植物的細胞組織間起"黏合"作用。近幾年來，果膠質的生物降解日益引起國內外學者的廣泛關注。能夠分解果膠質的酶被稱作果膠酶(pectinase)，它廣泛存在于各種微生物中，細菌、真菌和放線菌都能產生相關酶類。果膠酶類的應用領域非常廣泛，不僅可用于食品工業如水果加工及葡萄酒生產等方面，還廣泛應用于麻類脫膠、木材防腐、生物制漿、環境保護、污物軟化處理和飼料等行業中。果膠酶主要分為原果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果膠酯酶等幾大類，研究果膠酶各組分的性質，有利于果膠酶的單一酶種的開發利用。同時微生物果膠酶的分子生物學研究將有助于更合理地利用果膠酶。

1、 果膠簡介

果膠分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈，常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側鏈，游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子，特別是與硼化合物結合在一起[1]。它存在于所有的高等植物中，沉積于初生細胞壁和細胞間層，在初生壁中與不同含量的纖維素、半纖維素、木質素的微纖絲以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交聯，使各種細胞組織結構堅硬，表現出固有的形態．果膠分子的結構因植物的種類、組織部位、生長條件等的不同而不同，其大致的結構簡圖如圖1所示，總體可分為光滑區(smooth region)和須狀區(hairy region)兩部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三個結構區域構成，其中RG-II常以二聚體的形式存在．同其它植物多糖一樣，果膠也是多分子的、多分散的、多結構的、有高級空間構象的，也具有一定的相對分子質量分布。

2、果膠酶分類

從廣義上講，果膠酶可以被分為3種類型：①原果膠酶：可以把不溶于水的原果膠分解為可溶于水的高聚合體果膠；②果膠酯酶：脫去果膠中的甲氧基基團，促使果膠的脫甲酯作用；③解聚酶：促使果膠中D-半乳糖醛酸的α-1，4糖苷鍵的裂解。近來人們提出了更詳細分類方法為[3]：原果膠酶(protopectinases)、多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)、裂解酶(pectin lyases, PL)、果膠酯酶(Pectinesterase, PE)。

2.1　原果膠酶

Briton等人[4]把能夠促使原果膠溶解的酶命名為原果膠酶。根據其作用機理分為兩種類型：A型原果膠酶與B型原果膠酶。前者主要作用于原果膠的內部的多聚半乳糖醛酸區域。而后者主要作用于外部的連接聚半乳糖醛酸鏈和細胞壁組分的多糖鏈。

2.2　多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)

聚半乳糖醛酸酶是在有水環境下促進聚半乳糖醛酸鏈水解的一種果膠酶，應用最為廣泛。根據水解作用機理不同，它可以分為內切聚半乳糖醛酸酶 (E.C.3.2.1.15)和外切聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.67)。外切酶又可以劃分兩種類型：一種是真菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的終產物是單體半乳糖醛酸；另一種是細菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的終產物是二聚體的半乳糖醛酸。

2.3　裂解酶(pectin lyases，PL)

裂解酶(反式消去酶)是通過反式消去作用裂解果膠聚合體的一種果膠酶，裂解酶在C-4位置上斷開糖苷鍵，同時從C-5處消去一個H原子從而產生一個不飽和產物。根據其作用機理以及作用底物的不同，裂解酶可以劃分為：① 內切聚半乳糖醛酸裂解酶(EndoPGL，E.C.4.2.2.2)；② 外切聚半乳糖醛酸裂解酶(ExoPGL，E.C.4.2.2.9)；③內切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(EndoPMGL，E.C.4.2.2.10)；④外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(ExoPMGL)。

3、 果膠酶產生菌

目前國內外研究和應用較多的果膠酶產生菌是細菌和霉菌[5, 6]，也有鏈霉菌產生果膠酶的報道[7]。在細菌中，歐文氏桿菌(Erwinia sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、節桿菌 (Arthrobacter sp.)和假單胞桿菌(Pseodomonas sp.)都產生果膠酶。嗜堿性芽孢桿菌屬和歐文氏桿菌屬主要用于在苧麻和紅麻的脫膠、生物制漿及污物的處理軟化等方面，應用前景可觀，受到較多的關注和研究。已見報道的產果膠酶的霉菌種類大約包括20個屬， 如曲霉屬(Aspergillus sp.)、灰霉菌屬(Botrytis sp.)、鐮孢菌屬(Fusarium sp.)、炭疽菌屬(Colletotrichum sp.)、核盤菌屬(Scletorium sp.)和玉圓斑菌屬(Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾殼霉作為產果膠酶的菌株已經商品化。國內外對霉菌發酵產果膠酶的研究主要集中在曲霉屬中，而曲霉屬中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果膠酶被廣泛應用于食品工業中，如用于果汁、果酒及中藥營養液的深加工等，使得產品質量和外觀得以改善，而生產食品酶制劑的菌株必須是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系較全，不僅可以產生大量果膠酶，而且黑曲霉屬于安全菌株。另外，黑曲霉產生的果膠酶最適pH值一般在酸性范圍內，這也是其被應用于食品工業行業中的原因之一。

A型原果膠酶主要來源于酵母及酵母狀真菌的發酵液中。研究人員已經從Kluyveromy cesfragilis IFO0288. Galactomyces reesei L.和Trichosporon penicilla- tum SNO 3[8]中分離出了原果膠酶．依次稱為原果膠酶-F，-L和-S(PPase-F.-L.-S)，另外從Bacillus subtilis IFO12113，B．subtilis IFO3134和Tramete sp.菌株中分離出了B-型原果膠酶[8]，依次稱為原果膠酶-B，-C和-T(PPase-B，-C和-T)。

內切聚半乳糖醛酸酶廣泛分布于真菌和細菌中，在一些高等植物和寄生于植物的線蟲中我們也發現了此種酶。據報道，現在已經在許多微生物的菌體中發現了這種內切酶，包括Aureobasidium pullulans，Rhizoctoniasolani Kuhn，Fusarium moniliforme，Neurospora crassa，Rhizopus stolonifer，Aspergillus sp，Thermomyces lanuginosus，Peacilomyces clavisporus等。科研人員已經在大量的微生物種類中，對內切聚半乳糖醛酸酶進行了克隆復制，在遺傳學方面進行了大量的研究。相對而言，產生外切聚半乳糖醛酸酶的微生物較少。已經報道的產生外切活性酶的微生物有：Erwiniacarotovora,Agrobacterium tumefaciens,Bacteroides thetaiotamicron，E．chrysanthemi，Altemaria mali，Fusarium oxysporum，Ralstonia solanacearum，Bacillus sp.等[9-11] 。

聚半乳糖醛酸裂解酶(PGLs)可以由多種細菌和一些致病性的真菌產生，內切聚半乳糖醛酸裂解酶比外切聚半乳糖醛酸裂解酶要豐富。可以從腐爛食物中的細菌和真菌中分離到PGLs。據報道，從Colletotrichum lindemuthionum，Bacteroides thetaiotaomicron，Erwinia cartovora，A mucala sp，Pseudomonas syringae pv．Glycinea, Colletotrichummagna,E．chrysanthemi，Bacillus sp，Bacillus sp．DT-7，C. gloeosporioides等[12,13]

菌株中可以分離到此種酶。相比之下關于聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGLs)的產品卻鮮于報道，僅有少數報道指出我們可以從As． pergillusjaponicus，Penicillium paxilli，Penicillium sp．，Pythium splendens ，Pichia pinus，Aspergillus sp．，Thermoascusauratniacus中分離到此種酶[13-16]。

３、果膠酶的理化性質

3.1 　果膠酶活力檢測方法

掌握可靠的酶分析定量方法是開展果膠酶研究工作的重要前提。果膠酶的測定方法很多，各具特點，且酶活單位的定義不同，要根據不同情況加以選擇對比。常用的酶活力測定方法有[17]：

3.1.1　滴定法

滴定法主要用于測定果膠酯酶的活力，根據該酶作用機制，采用滴定羧基來評價酶活。果膠酯酶的活力還有一種測定方法，即，通過氣相色譜或液相色譜儀定量分析甲醇，根據甲醇的生成量來評價酶活，此方法比較精確但要求較高。

3.1.2　黏度下降法

黏度下降法基于果膠物質在酶的作用下大分子降解伴隨底物溶液黏度下降這一事實，以底物黏度下降的百分比來評價酶活。該方法所測定的酶活性，主要是反映內切酶酶活。

3.1.3　脫膠作用時間法

該方法根據果膠物質在未被酶解之前以及在酶解反應的不同時期能在異丙醇溶劑中形成大小不等的膠團而判斷酶的活性。該方法最能反映內切水解酶和內切裂解酶兩種酶在實驗條件下的綜合能力。

3.1.4　還原糖測定法

無論是內切還是外切果膠酶的作用，長鏈果膠分子的糖苷鍵斷裂結果都產生還原端基。這些還原端基的生成量。可用來表示酶活性。最為常用的為DNS(3，5－二硝基水楊酸)法。

3.1.5　235nm處紫外吸收測定法

這是專門測定裂解酶活力的一種方法。裂解酶作用于底物經歷一個β－消除反應，使底物生成非還原末端C4、C5 之間帶有雙鍵的產物，該產物在235nm處產生最大紫外吸收，酶活性測定正是根據該反應產物而設計的。

3.2　微生物果膠酶的酶學性質

國內外科學家利用層析、電泳等手段對果膠酶的酶學性質進行了研究，明確了一些果膠酶的分子量、動力學性質及其影響因素。常用果膠酶純化方法有：硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、離子交換層析以及凝膠過濾色譜等。果膠酶分子量一般在20kD~60kD之間，單體存在，個別以多聚體形式存在，如海棲熱袍菌果膠酸裂解酶分子量為115.2kD，結構為四聚體。通常果膠酶活性范圍在pH3.0~9.0，等電點pH4.0~9.0。其中，最適pH4.0~6.5的為水解酶，其作用不需要Ca2+參與。而裂解酶的作用需要Ca2+參與，最適pH為8.0~10.0。不同菌種所產果膠酶性質有所不同。Alana等人[18]采用了半固體和液體發酵兩種不同的培養方式，采取凝膠過濾色譜和層析聚焦兩種生化手段對Penicillium italicum生產果膠酶進行研究，發現兩種培養方式產生的酶分子量、等電點、Km都相同，分別為22kD、8.6、3.2mg/ml。最適作用溫度 50℃，最適pH6.0~7.0，遠低于細菌果膠裂解酶最適pH，Co2+、Cu2+、Fe2+ 是其抑制劑。不同的是：該菌株液體發酵分泌果膠裂解酶可在低pH條件下由高酯果膠誘導。半固體發酵產生的果膠裂解酶活力高，專一性較差。Bruhlmann F[19]對無枝酸菌果膠裂解酶進行了純化鑒定。該酶分子量為31kD，最適pH為l0.25，等電點為10.0，在pH6.0~8.0內酶活穩定，Ca2+是其保持活性的必需離子。并對該酶降解果膠的產物進行了研究，先通過體積排阻色譜分離果膠酶降解產物，然后由快原子轟擊電離質譜確定其組分，結果顯示酶解反應初期就產生了大量的不飽和寡半乳糖醛酸，證明了該酶是內切酶。Saccharomyces eerevisiae的基因PGL1-1 編碼的聚半乳糖醛酸酶，分子量42kD，最適作用溫度25℃，最適作用pH4.0，在pH3.0~5.0內酶活穩定，pH3.0時酶活保留80％，耐酸能力極強[20]。

其它微生物果膠酶的生化特性見表1[21,22]。

4、果膠酶的生物學研究

4.1 果膠酶的理化性質

果膠酶是作用于果膠質的一類酶的總稱，主要功能是通過裂解或β消去作用切斷果膠質中的糖苷鍵，使果膠質裂解為多聚半乳糖醛酸。真菌分解果膠類物質的酶主要是耐酸的多聚半乳糖醛酸酶和耐堿的果膠裂解酶，以內切型(endo-)為主，也有外切型(exdo-)。一些真菌也產生果膠酯酶和鼠李半乳糖醛酸酶(RHG)等。PG作用的最適pH值一般低于 6，大部分PG最適作用溫度為45℃，相對分子質量(Mτ)為30 000～50 000，其前體蛋白一般包含360～390個氨基酸殘基，基中N端信號肽為17～40個殘基。PL一般作用的最適pH 值大于9，最適作用溫度在55℃左右，其前體蛋白一般為370-380個殘基，但有的低于250個殘基，有的無N端信號肽。已報道的PE前體蛋白為331 個殘基[23-25]。

真菌果膠酶一般有糖基化位點，功能酶以糖蛋白形式存在。如串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)的endo-PG前體有4個糖基化位點；玉米圓斑病菌(Cochliobolus carbonum)的PGX1 N端有12個殘基的糖基化位點，糖蛋白Mτ為60 000。對24種曲霉PG的分析表明，一個內藏的Tyr殘基與酶催化作用關系密切，在pH l0.5時離子化；一個外露的Tyr殘基在pH9.3～9.5時離子化，可能與酶催化有關。串珠鐮孢endo-PG的His234對酶活性和浸解活性起關鍵作用，與結合PG1P無關，當His234→Lys時無酶活，Ser237和Ser240→Gly時，酶活性分別降低48％和6％[23-27]。纖維素結合域(CBD)在纖維素酶和木聚糖酶中廣泛存在，但在果膠酶中不常見。目前發現一種來自膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的果膠酶含有CBD，這是迄今發現的第一種含有CBD的果膠酶。

細菌產生的果膠酶的Mτ為10 000～80 000， 最適作用pH值一般中性偏堿，最適作用溫度一般為60℃左右。菊歐文氏桿菌(Erwinia chrysanthemi)產生8種果膠裂解酶的同工酶，但其中的PELI 更易作用于部分甲酯化的果膠，在最適堿性pH值和Ca+2存在的條件下，還具有內切活性。菊歐文氏桿菌分泌果膠乙酰酯酶，Mτ為34 9OO，前體蛋白含322個殘基，N端有21個殘基的信號肽。

酵母中只有很少一部分株系產生果膠酶，釀酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)endo-PG 的前體蛋白含360～380個殘基，基中N端從1-18殘基為信號肽序列，381～388殘基的位置有糖基化位點，His222為酶的活性區域。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)產生的endo-PG的氨基酸序列與真菌的PGs有一定的相似性，N端25個殘基為信號肽序列，218～230殘基為PG的活性區域。

4.2 微生物果膠酶基因

近10年來，已從不同屬的真菌、細菌和放線菌中克隆和測序的果膠酶基因至少有70個(表1)，其中來自真菌的超過40個，且大多是多聚半乳糖醛酸酶基因。從中克隆到果膠酶基因的真菌主要有曲霉菌、炭疽菌、鐮刀菌和灰霉菌等。例如目前已從黑曲霉(Aspergillus niger)中克隆到6個多聚半乳糖醛酸酶基因，6種endo-PGs之間的氨基酸序列同源性達58％～68％。草莓灰霉(Botrytis cinerea) 的6種endo-PGs的氨基酸序列同源性達34％～73％，聚類分析表明分屬于3中不同的單系群體。在細菌中，對歐文氏桿菌的果膠酶基因研究較多，已經從菊歐文氏桿菌中克隆了8個果膠裂解酶基因和2個果膠酯酶基因，8個果膠裂解酶基因之間的氨基酸序列有很高的一致性，但Pell與其他7個不同，它自成一個轉錄單元。產生果膠酶的酵母菌株比較少，從釀酒酵母中克隆到的果膠酶基因是內切多聚半乳糖醛酸酶基因PGL1和PGU1，在基因組中均是單拷貝存在的。

真菌果膠酶基因的開放閱讀框絕大多數被內含子分割。曲霉菌的果膠酶基因均含有內含子， 多數為3-4個，最多的達7個，如A．tubingensis的多聚半乳糖醛酸酶基因pgaX 。除Bcpgl不含內含子外，草莓灰霉的其他5個endo-PGs基因均含內含子。微生物果膠酶基因的表達與調控許多微生物果膠酶基因已在酵母菌中被正確表達。如茄鐮孢豌豆專化型pelB、pelC和pelD的cDNA轉入巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)可以表達。果膠酶一般受果膠、植物維管組織、低濃度的(0.1％)D一半乳糖醛酸、半乳糖誘導，受葡萄糖、較高濃度(1％)的半乳糖醛酸、抗體、某些抗菌素(如阿莫西林)、植物的PG抑制蛋白(PGIP)抑制。有些果膠酶基因組成型表達。

5、果膠酶的應用

5.1 利用果膠酶瓦解植物細胞的細胞壁

5.1.1 果蔬汁的生產，果酒的澄清

目前，在大部分的原果汁、濃縮果汁的生產過程中，都在使用果膠酶．由于各種水果中果膠的含量差別較大，而且果膠質的成分也略有差異，因此，要根據不同品種、不同加工目的來確定果膠酶的酶組成。由于PG 的專一性對果膠的酯化度要求不如PL高，在澄清果汁方面往往注重以PG為主的酶組成，而在提高浸出汁。特別是自流汁方面往往注重使用以PL為主的酶制劑。

5.1.2 天然產物的提取

果膠物質的存在不同程度的影響或阻礙著天然產物的釋放。在適宜條件下，植物細胞會發生自溶也可產生包括果膠酶在內的分解酶類，但這會使待分離產物發生結構改變，甚至產生一些大多數情況下不利于分離的小分子副產物，因此，靠植物細胞的自身酶系并不利于天然產物的提取。一般應先熱失活鈍化胞內酶系，再有選擇地進行酶處理。天然色素如葡萄紫、番茄紅、紫蘇紫、蘿卜紅等均可使用酶法提取，但所用果膠酶不得含有花青素酶等雜酶以免影響某些產品色澤。其次，天然生物活性物質提取物是目前中藥進入國際市場的一種理想方式，出口比例已超過中藥，并呈上升趨勢。可利用果膠酶生產的提取物有：銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿、當歸浸膏、甘草液等。另外，在金耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖、山楂葉總黃酮。等的提取中也使用了果膠酶。利用酶類提取，不僅可提高萃取率，還可提高純度。另外，在油料萃取方面，按照傳統的生產工藝，菜籽油、棕櫚油、葵花籽油、橄欖油等一般是由正己烷等脂溶性溶劑萃取制得，而正己烷是一種致癌物質。將果膠酶和纖維素酶、半纖維素酶結合使用，可破壞油料作物的細胞壁，便于油料的釋放，從而提高萃取率。由于酶法提取條件溫和，油料中多酚物質和VE都有所增加，從而提高油料的穩定性。

5.1.3 紡織品的生物脫膠

用堿性果膠酶處理，代替堿對棉、麻等織物進行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質，在比較緩和的pH值和溫度條件下使處理后的織物手感柔軟，強度高，取代了耗能大、污染嚴重的傳統熱堿脫膠工藝。另外，可避免因微生物處理造成的纖維素的降解。

5.1.4 造紙業的生物制漿

造紙工業中的生物制漿與紡織品的生物脫膠類似，都是通過果膠酶等酶處理降解植物纖維原料中的果膠、半纖維素及木質素，使其分散成滿足造紙工業不同要求的束纖維或單纖維，以生產柔軟、均一、有彈性的高品質材料。由于紙漿中高分子果膠帶負電荷，經酶降解至六糖以下即可將其除去，避免了成品紙的靜電現象。

5.2 部分分解細胞間質中的果膠物質

5.2.1 帶果肉食品的生產

一般常規加工所得到的果肉在必要的高溫處理或機械泵出后，成型顆粒量明顯減少，硬度降低，直接影響了產品品質。果膠質在PE作用下脫去甲氧基，在鈣離子存在下形成凝膠，從而保持了果肉原有的形狀和硬度．以此為基料的產品有果汁、果凍、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。

5.2.2 單細胞產品的生產

所謂單細胞產品是指將生物組織進行轉化而形成的完整的單細胞懸液。這種單細胞內各種營養成分保存完好，表面及內部的張力較小，易穩定存在，而且易被酶類消化．它最初應用于細胞融合技術，隨著制備技術的不斷完善，這種單細胞產品可用于嬰兒、老人及病人食品中，還可作為美容品中的活性成分，用于保濕、抗氧化、抑制黑色素生成等。酶法降解植物細胞聞質中的果膠物質產生完整的單細胞懸液的過程稱為浸解作用(maceration)．在浸解過程中，一方面設法使內源性果膠酯酶滅活，避免細胞軟化；另一方面，用外源果膠酶適度降解胞外果膠及其它成分，避免胞內物質泄漏，降低品質。該工藝常用于生產帶肉果蔬汁飲料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡蘿卜泥等食品，以及蘆薈、人參、越橘葉、紅花等美容保健品的配料。

5.3 利用果膠酶生產果膠低聚糖

5.3.1 以果膠為底物生產低聚果膠

PG可水解細胞壁中的果膠成分產生聚合度為10左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反應的誘導因子，防御作用包括產生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制劑等等，而且當endo-PG與其抑制蛋白結合以后可進一步激活此防御反應，所以PG在植物致病、抗病中具有雙重作用．某些中草藥中的藥用成分也與果膠成分有關，如艾草葉中的果膠成分是一種生物活性成分，柴胡根中的抗潰瘍糖類與果膠分子中的RG-II有關，而人參葉中的RG－Ⅱ也具有抗潰瘍作用，柴胡根中的RG-I能夠促進

鼠B細胞產生IL-6，增進機體免疫力，蒼術根中的果膠片段具有腸道免疫活性。此外，果膠酶解產物還具有抑菌活性，可顯著抑制乳酸菌的生長，還可作為功能性食品的配料。

5.3.2 以幾丁質、幾丁聚糖為底物生產低分子寡糖

PG可水解幾丁質、幾丁聚糖的β-(1，4)-糖苷鍵，得到水溶性寡糖。這類低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、增強免疫機能，改善腸道微生物區系的分布，刺激有益菌的生長等．另外，幾丁寡糖可作為保水劑、抗菌劑、植物生長調節劑等應用于農業、食品和化妝品業。

參考文獻

[1] Pérez S, Rodriguez-Carvajal M A, Doco T．A complex plant cell wall polysaccharide：rhamnogalacturonan IL A structure in quest of a function[J]．Biochimle,2003,85:109-121.

[2] Serge Pérez, Karim Mazeau, Catherine Herv du Penhoat. The three-dimensional structures of the pectic polysaccharides[J]. Plant Physiol．Biochem.2000, 38(1/2): 37-55.

[3] 張海燕，吳天祥。微生物果膠酶研究進展[J]。釀酒科技，2006, 9: 82-85

[4] Lang C, Domenburg H. Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2000, 53: 366-375.

[5] Kapoor M, Beg QK, Bhushan B, et a1．Production and partial puriflcation and characterization of a thermo-alkalistable polygalacturonasefrom Bacillus sp. MG-cp-2[J]. Process Biochem, 2000, 36: 467.

[6] Antier P, Minjares A, Roussos S, et a1．Pectinase hyperproducing mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid state fermentation of cofee pulp[J]．Enzyme Microbial Tehnol, 1993, 15: 254.

[7] Beg QK, Bhushan B, Kapoor M, et a1．Effect of amino acids on production of xylanase and pectinase from Streptomyces sp.QGl1-3[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2000, 16:211.

[8] Lang C，Domenburg H．Perspectives in the biological functionand the technological application of poly- galacturonases[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 53: 366-375.

[9] AlkortaI，Garbisu C，Llama MJ，Serra JL. Industrial applications of pectic enzymes-a review[J]．Process Biochem，1998．

[10] Prade RA，Zohan D，Ayoubi P，Mort AJ．Pectins，pectinases and plant-microbe interactions[J]．Biotechnol Genetic Eng Rev1999，l6：361-391．

[11] Hasunuma T，Fukusaki EI，Kobayashi A．Methanol production is enhanced by expression ofan Aspergillus niger pectin methylesterase in tobacco cells[J]. J Biotechnol 2003, 106: 45-52.

[12] Hadj-Taieb N，Ayadi M，Tfigui S，Bouabdollah F，Gargouri A．Hyper production ofpectinase activities by fully constitutivemutant(CT1)of PeniciUium occitanis[J]. Enzyme Microbial Technol, 2002, 30:662-666.

[13] Innocenzo MD, Lajalo FM．Effect of gammairradiationons oftening changes and enzyme activities during ripening ofpapaya fruit[J]. J Food Biochem. 2001,25:19-27.

[14] Assis SA, Ferreira BS, Fernandes P, et al. Gelatin immobilized pectinmethylesterase for production of low methoxyl pectin[J]. Food Chem. 2004, 86:333-337.

[15] Reid I, Richard M. Purified pectinase lowers cationic demand　in peroxide-bleached mechanical pulp[J]. Enzyme Microbial Technol. 2004, 34: 499-504.

[16] Maldonaldo MS, Saad AMS. Production ofpectiIlesterase and polygalacturonase by Aspergillus n r in submerged and solid state systems[J]. J Ind Microbiol Biotechnol. 1998, 20:34-38.

[17]賈月, 弓愛君, 邱麗娜, 等．果膠酶分離純化及分析方法的研究進展[J]. 工業微生物, 2005, 35(1): 55-58．

[18] A1ana A, Alkorta I, Dominguez J B, et al．Pectinlyase activityin a Penicillum italicum strain[J]．Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56: 375-3759．

[19] Bruhlmann F. Purification and characterization of an extracellular pectatelyase from an Amycolata sp.[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61:3580-3585.

[20] Gainvors A, Nedjaoum N, Gognies，et a1. Purification and characterization of acidic endo-polygalacturonase encoded by the PGL1-1 gene from Saccharomyces cerevisiae[J].FEMS Microbiology Letters,2000, 183: 131-135．

[21]Schlemmer A F, Ware C F, Keen N T. Purification and characterization of a pectin lyase produced by Pseudomonas fluorescens W51[J]. Bacteriology, 1987.169: 4493-4498．

[22] 張紅霞, 江曉路, 牟海津.微生物果膠酶的研究進展[J].生物技術, 2005, (15):92-95

[23] 高必達. 真菌果膠酶的分子生物學研究進展[J]. 生物工程進展, 2000, 20(6):14.

[24] Parenicova L, Benen J A, Kester H C, et a1. pgaA and pgaB encode two constitutively expressed endopolygalactumnases of Aspergillus niger[J]. Biochem J, 2000, 345: 637.

[25] Wubben J P, Mulder W, ten Have A, et al. Cloning and partial characterization of endopalygalactumnase genes from Botrytis cinerea[J]. Appl Envir Microbiol, 1999, 65:1596.

[26] Di Pietro A, Roncero M. Cloning, expression, and role in pathogenicity of pgl encoding the major extracellular endopolygalacturonase of the vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum[J]. Mol Plant Microbe Interact, 1998.11(2): 91.

[27] Wei Y, shih J, Li J, et a1. Two pectin lyase genes, pnl-1 and pnl-2, from Colletotrichum gloeosporioides f. sp．malvae differ in a cellulose-binding domain and in their expression during infection of Malva pusilla[J]. Microbiology, 2002, 148(7):2149.