圖 7：與預測生成的碎片離子匹配后得到的實驗二級質譜圖（a）氯羥基雜質（b）二氯雜質和（c）二氫雜質，與Mass Frontier 軟件預測匹配的實驗碎片離子用紅色標記
圖7 為與預測的碎片離子相比較后的三個雜質的實驗二級質譜圖。Mass Frontier 的預測是基于圖3 中三個雜質推斷的結構給出的。和圖6 一樣，如預測的碎片離子和實驗二級質譜中的離子匹配用紅色標記。可以看到，實驗得到的二級質譜的所有主要離子都被紅色標記，這有力支持了所推斷結構的有效性。表1 匯總了Mass Frontier 軟件預測碎片結構和實驗二級質譜的相關性結果，來驗證圖3 推斷的雜質結構。為了理解如何獲得到這樣的結果，必須意識到除了取代發生的位置（圖1 和圖3 紅色標識），所提議的藥物中間體結構和三個雜質結構是相似的。因此，如果實驗得到的四個化合物的二級質譜中，每個化合物都有特定的碎片離子，而Mass Frontier 預測能給出相同的裂解機理，那么所提議的三個雜質結構就是正確的：
● 如果Mass Frontier 軟件預測碎裂機理生成的碎片結構不包含取代位，那么在實驗得到的四個二級質譜圖中應有相同質荷比的碎片離子。
● 如果Mass Frontier 軟件預測碎裂機理生成的碎片結構包含了取代位（即如果實驗得到的二級質譜圖中藥物中間體的碎片離子的質荷比為M，那么在二氫，氯羥基，二氯取代雜質分別應該有M+2, M+52 和M+70 質荷比值），那么碎片離子的質荷比應存在取代基質量數的差異。
在表1，Mass Frontier 軟件指定具有相同裂解機理的碎片離子被以相同顏色加重。這樣可以從表中看出，在所有情況下，由Mass Frontier 預測形成機理得到的有關聯的碎片離子要么有相同的實驗質荷比，要么有與取代基差異的實驗質荷比，這依賴于Mass Frontier 預測的碎片結構是否有取代位。通過觀察證明了所推斷的雜質結構的有效性。
表1. Mass Frontier 軟件結構預測匯總
結論
在數據相關二級質譜模式和動態排除的支持下，檢測和表征了含量在0.1％或以下的ZL藥物中間體的三個雜質。同位素分布和質量差說明了推斷結構的合理性，并由Mass Frontier 所驗證。通過Mass Frontier 預測碎片離子和實驗得到的二級質譜圖離子的比較，確定了所建議的三個雜質結構。該分析支持以下的結論：三個雜質都來自于藥物中間體某雙鍵位置的化學取代。
● 所要分析的雜質含量是母體成分豐度的0.1％以下，這是法規所要求的。Finnigan LCQ 離子阱質譜儀具有高靈敏度和高選擇性，數據相關掃描模式，是成功完成雜質分析的必備工具。
● Mass Frontier 譜圖管理和碎裂機理模塊技術能夠快速方便地完成結構分析，并能對推斷的雜質結構予以確認。