常用的幾種細胞凋亡檢測方法詳細步驟（三）

第六種  Caspase-3活性的檢測 

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

1 、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4℃過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4℃過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

結果：[圖 9-1,9-2]

2 、熒光分光光度計分析

原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS洗滌，制備細胞裂解液，加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物），37℃反應1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。

結果：[圖 10]

3、 流式細胞術分析

方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC37℃反應1h，UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。　

結果：[圖 11]

第七種  凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析 

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。）TFAR19蛋白的細胞定位分析

材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。

儀器：低溫水平離心機, 37℃水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計