小鼠誘導性多能干細胞誘導及建系

實驗概要

小鼠誘導性多能干細胞誘導及建系

主要試劑

0.05%Trypsin、0.25% Trypsin、0.1%明膠、細胞基礎培養液、DPBS、凍存液A、iPSCs誘導培養液

實驗材料

35 mm、60 mm、100 mm培養皿，15 mL、50 mL離心管、體視鏡

實驗步驟

①每隔24 h為感染后的細胞換液，繼續用細胞基礎培養液進行培養。
②轉染后第3天，即Day 3，制備1個12孔培養板的飼養層細胞。
③轉染后第4天：將轉染的細胞用0.05%Trypsin消化，用細胞基礎培養液終止，收集細胞懸液至1個15 mL的離心管中，室溫1000 r/min離心5 min；棄上清，用5 mL iPSCs誘導培養液將細胞重懸，并用細胞計數板計數；按照1.25×104 cells/孔的密度，將轉染的細胞接種到12孔培養板的飼養層細胞上，用iPSCs誘導培養液培養，每天為細胞換液。
！注意：接種在飼養層細胞上的細胞的密度對于誘導效率有很大的影響，如果密度太高（＞1.5×104 cells/孔），在誘導晚期會出現明顯的細胞死亡。
④每天觀察細胞形態的變化，當出現與正常的mESCs形態接近的克隆時，即可挑取克隆進行單克隆培養，一般轉染后12～21天開始挑克隆；miPSCs細胞核大，胞核中多為常染色質，胞質胞漿少，結構簡單，細胞排列緊密，呈集落狀生長。如圖4-1所示為MEF感染Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc因子后形成的iPSC克隆。
⑤克隆挑取前一天，制備多個4孔培養板的飼養層細胞。
⑥挑克隆：在多個國產35 mm培養皿蓋上制備4個0.25%Trypsin滴，放在培養箱中。
！注意：制作酶滴一定要在非貼附的皿上進行，否則酶滴易擴散。
⑦在酒精燈上拉制數根玻璃針，要求針尖較細（孔徑應相當于一個克隆大小）。
！注意：挑克隆的針與吹吸克隆的針的口徑應該不同，挑克隆的針口徑較大（與一個克隆的大小接近），吹吸克隆的針口徑較小（要比克隆小）。
⑧為4孔培養板的飼養層細胞換液，換為miPSCs培養液。
⑨在體視鏡下，用玻璃針挑取較好的克隆，轉移到0.25%Trypsin滴中消化5 min，將消化完的克隆吸到4孔培養板中，并用移液槍反復吹打，直至將克隆吹打成單細胞。。