大片段的精確擴增實驗

甜菜堿 PCR 反應緩沖液 TEN+BSA 酶和酶緩沖液 核酸及引物

PCR 儀

一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
滅菌水配制的下列試劑，儲存在指定的溫度條件下。
(1) 5mol/L 甜菜堿（SigmaB-2629 或 SigmaB-2754)
過濾滅菌，室溫保存。
(2) 10XKLA PCR 反應緩沖液，pH9.2
500 mmol/LTris 堿 (Sigma;Trizma 堿)
169 mmol/L(NH)₄SO₄
25 mmol/LMgCl₂
1%Tween20
不 用調節，pH 約 9.2(大片段擴增最佳），對于一些質粒，如 col El,pH7.9 比較適宜（見第 29章); 用 2mol/L 的 HCl 10XKLA 到 pH7.9, 不要將 pH 計直接插入到緩沖液中，以免外界 DNA 污染，可以取一小滴檢測。要避免 10X 緩沖液結冰，過濾滅菌后儲存于 4°C(如果緩沖液變得渾濁，用前搖勻仍可使用)。對于 Kletaq LA,Mg²⁺濃度很重要。在全長 Taq 酶擴增體系中（10XTLA),MgCl^₂ 只有7.5 mmol/L。
(3) TEN+BSA
10 mmol/L Tris-HCl(pH7.9)
10 mmol/L NaCl
0.lmmol/L  EDTA
100ug/ml  BSA
-20°C保存。
一般用 TEN+BSA 稀釋模扳 DNA 至 10ng/ml(或低于），這樣可以增加重復性，特別是凍存后。
2. 酶和酶緩沖液
Klentaq LA 為 50?55U/ul(推薦的酶濃度，根據復制子的長度而不同；見 6.1 疑難解答②)。
3. 核酸及引物
(1)10/40dNTP 混合物
每種 dNTP10 mmol/L
40 mmol/LMgCl₂
每 種 dNTP 可以從 Pharmacia Biotech 購得干粉，溶解成 l0mmol/L, 儲存于-80°C。一般以 500/ul 分裝dNTP 混合液儲存于一 80°C, 如果常用則儲存于-20°C。用 dNTP 混合液比購買 dNTP(100 mmol/L) 更有利于獲得高產 PCR 產物。作者沒有用新購的 dUTPase 作比較，因此用 dUTP 可能有點問題。
(2)10umol/L 引物
將引物稀釋到 l0pmol/L,50ul 反應體系中加入 1ul，-20°C 保存.
4. 設備
PCR 儀。
二、方法
1.冰上加入下列試劑。
10XKLA,pH9.2，有些質粒用 pH7.9                                                60ul
10/40dNTP 混合物，終濃度為每種 l00umol/L                                6ul
5mol/L 甜菜堿（終濃度 1.2mol/L), 部分質粒終濃度可達 2mol/L    156ul
H₂0                                                                                                 345ul
KlentaqLA(如果靶 DNA 小于 2kb，加 lul 即可）                             3ul
混勻
2.取出 48ul, 加入 2ul 引物，作為對照。
3.剩余的溶液中加入濃度為 l0ng/ul 基因組 DNA, 混勻。
4.每管取 48ul。
5.每管中加入上下游引物各 1ul, 也可以將上下游引物混在一起，加入 2ul。不要擔心混合不均勻，因為 PCR 擴增過程中的對流足以將其混勻。
6.編制 PCR 擴增程序時，每一個循環的加熱時間約 5?10s, 有的 PCR 儀可能說明 5?50s，不同的 PCR 儀可能有所區別。
每一個循環 92°C 50s , 63°C 10 min。按以下設置循環數。