83. 用作測序的 2 ul PCR 產物（所需的確切用量取決于測序的方案，并應當優化）用下述方法處理：
0.1 ul 外切核酸酶 I
0.1 ul 蝦堿性磷酸酶
1.8 ul 50 mmol/L Tris·Cl，pH 8. 0
加 2 ul 消化混合液到 2 ul DNA 中。
84. 在熱循環儀上進行反應，37°C 溫育 15 min, 然后 80°C 加熱 15 min。加水到 15 ul。直接取 2 ul 稀釋的 PCR 產物測序。
85. 從 SAGEnet 下載 SAGE 的分析軟件（見因特網資源），按說明分析。
收起
注意事項
其他
1. 材料：
感興趣的細胞或組織
2. 試劑：
含以下成分的 Dynbeads mRNA DIRECT 試劑盒（Dynal Biotech）：
Dynbeads oligo （dT）25
裂解/結合緩沖液
洗滌緩沖液 A
洗滌緩沖液 B
10 mmol/L Tris·Cl 再生緩沖液
儲存緩沖液oligo （dT）25
20 mg/ml 糖原，分子生物學級（Roche Diagnostics）
含以下成分的 SuperScript Choice System cDNA 合成試劑盒（Life Technologies）：
5×第一鏈緩沖液
DEPC 處理的雙蒸水（DEPC ddH2O）
0.1 mol/L DTT
10 mmol/L dNTP
200 U/ul SuperScript II 逆轉錄酶
5×第二鏈緩沖液
10 U/ul E.coli DNA 連接酶
10 U/V E.coli DNA 聚合酶 I
2 U/ul E.coli RNase H
5× T4 DNA連接酶緩沖液
1 U/ul T4 DNA 連接酶
0.5 mol/L EDTA， pH 8.0
2×BW緩沖液
0.1％ （m/V） SDS
100× 乙酰化的 BSA （New England Biolabs）
NlaⅢ 和 NEB 緩沖液 4 （New England Biolabs），保存在 -80°C
LoTE緩沖液
1％ （V/V）Tween 20
連接子
5 U/ul 高濃度的 T4 DNA 連接酶（Life Technologies）
BsmFI （New England Biolabs）
PC8
SeeDNA （Amersham Pharmacia Biotech）
3 mol/L 乙酸鈉
70％ 和 100％ 乙醇
DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段和 10× 緩沖液（Amersham Pharmacia Biotech）
3 mmol/LTris·Cl，pH 7.5
10× SAGE PCR 擴增緩沖液
DMSO （Sigma）
PCR引物
5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶（Life Technologies）
7.5 mol/L 乙酸銨（Sigma）
5× 上樣緩沖液
預制的 20％ （m/V）微型聚丙烯酰胺/TBE凝膠（Novex）
20 bp DNA ladder （GenSura）
SYBR Green I （Roche Diagnostics）
10× TBE凝膠電泳緩沖液
Qiaquick凝膠抽提試劑盒（Qiagen； 可選）
10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE凝膠
1 kb 的DNA參照
pZErO-1 質粒（Invitrogen）
SphI 和 NEB 緩沖液 2 （New England Biolabs）
TE緩沖液，pH 8.0
SOC培養液
0.01 ng/ul pUC19 對照質粒 DNA
DH10B電轉感受態細胞，冷凍（LifeTechnologies）
含 100 ug/ml 氨芐抗生素的 LB 平板
10 cm含 zeocin 的低鹽 LB 平板
Pfu DNA 聚合酶 I （Stratagene）
外切核酸酶 I （USB）
蝦堿性磷酸酶（USB）
50 mmol/L Tris · Cl， pH 8.0
3. 儀器耗材
0.5 ml 和 1.5 ml 無 RNase 的硅烷化的微量離心管（Ambion）
1.5 ml 微量離心管的磁座（Dynal Biotech）
0.5 ml、1.5 ml和 2 ml 微量離心管組織勻漿器（如 Polytron PT1200， Brinkmann Instruments）
16°C 水浴鍋（可選）
帶冷凍的熱控制/循環儀
96 孔 PCR 板
干冰/甲醇浴
帶固定轉頭或吊桶轉頭的臺式離心機
平臺型搖床
UV 盒和濾鏡
Spin-X 離心過濾管（Costar）
0.1 mm 微電擊杯
Bio-Rad 基因脈沖電轉裝置（或類似的裝置）
15 ml 培養管