基因編輯2.0升級版賦予更強個性化修改能力

“這項工作論證充分且十分有趣。”一位審稿人寫道，“引導編輯提供了對基因組進行定制化更改的能力，克服了堿基編輯器有限的替代能力。作者描述的引導編輯器可在植物基因組上將引導編輯效率提高數倍。”

“2.0時代”的引導編輯

在農業領域，基因組編輯技術可以更方便、快捷、精準地進行作物育種和改良。通過基因組編輯可以不添加任何外源性的基因，實現對基因組自身序列的修改，大大節省了時間和工作量。

事實上，基因組編輯技術從2012年誕生至今，經過10年的發展已經不僅僅是“一把剪刀”的概念。論文通訊作者、遺傳發育所研究員高彩霞在接受《中國科學報》采訪時介紹，進化至“2.0時代”的堿基編輯和引導編輯還可以是一塊“橡皮”或一支“鉛筆”。

“如果一個序列有點多，你可以把它剪掉；如果組成DNA的四個字母ATCG有一個錯了，你可以像用一個‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘鉛筆’寫入正確字母，而‘鉛筆’、‘橡皮擦’是不留在細胞里的。”她比喻說。

更具體地說，引導編輯系統（PE）是一種能夠在基因組的靶位點處實現任意堿基替換和小片段精準刪除、插入的新型基因組編輯工具，也是基因組編輯領域的重大變革。

2020年，高彩霞團隊率先在水稻和小麥中成功建立并優化了適用于植物的引導編輯器（PPE），開發了植物引導編輯向導RNA（pegRNA）設計網站——PlantPegDesigner，極大提高了引導編輯效率并簡化了植物pegRNA的設計流程。他們還通過全基因組重測序發現PPE系統在全基因組水平上具有很高的特異性。這些研究為引導編輯系統在植物領域的應用奠定了良好的基礎。

盡管如此，引導編輯系統目前在植物中的編輯效率仍不夠高，且有很大的靶點依賴性。“也就是說在一些內源靶位點上，現有的引導編輯系統效率仍然很低，尤其是針對一些較長片段的刪除、插入這種復雜的編輯類型。”論文第一作者、高彩霞課題組博士生劉怡靜向《中國科學報》解釋。

這些短板嚴重限制了引導編輯在植物中的廣泛應用。因此，如何優化引導編輯系統突破現有的限制，提升引導編輯技術的高效性、廣適性是一個研究重點。

尋找更高效“突破點”

萬事開頭難。如何去優化引導編輯系統，實現更高效、廣適的編輯呢？這是合作團隊一直思考的問題。為此，他們先后構思嘗試了多種不同策略，最終通過對蛋白的理性設計獲得了能夠穩定提高效率的ePPE的版本。

不同于大多數已報道的通過優化pegRNA提高引導編輯效率的思路，新型引導編輯系統ePPE側重于對引導編輯系統的蛋白組分進行改造。通過對不同策略構建的多種引導編輯系統進行篩選，研究人員發現刪除引導編輯系統中逆轉錄酶M-MLV RT（依賴RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNase H）結構域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣殼蛋白（NC），可分別將PPE的編輯效率提高2.0倍和3.2倍。

究其原因，他們推測，RNase H結構域的去除穩定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA復合體中的RNA-DNA異源雙鏈結構，NC蛋白通過其核酸退火活性在逆轉錄過程中輔助MLV-RT發揮功能。

研究人員進一步地通過整合以上兩種優化策略，開發出了升級版新型引導編輯器ePPE。相比于PPE，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下編輯效率平均可提高5.8倍，且不增加脫靶及副產物的發生。

“ePPE作為一個更高效、廣適的引導編輯器，可以算作是一支流暢合格的‘鉛筆’，一塊干凈好用的‘橡皮’了。”劉怡靜表示。

對此，另一位審稿人也表示：“這項研究在植物基因組編輯領域做出了及時而重要的貢獻。”

種質創新“小試牛刀”

除了高效和廣適性，合作團隊通過進一步研究發現，當把新型引導編輯器ePPE與該課題組此前報道的dual-pegRNA策略和哈佛大學、博德研究所教授劉如謙實驗室研發的epegRNA策略相結合時，可進一步提高引導編輯系統在內源基因上進行精準編輯的效率。

這些特性在很大程度上拓展了其應用范圍。基于此，研究人員利用ePPE系統成功創制了對兩種除草劑（甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆）具備抗性的水稻新材料。

劉怡靜介紹，乙酰乳酸核酶（OsALS）基因是支鏈氨基酸合成途徑中的第一個酶，諸如磺酰脲類、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草劑都是該酶的抑制劑，通過抑制支鏈氨基酸的合成導致植物死亡，從而除去很多雜草。同時，這類除草劑對哺乳動物毒性非常小，應用價值很高。

 “通過在ALS基因的特定位置上產生單個氨基酸的突變，可以獲得抗性酶，賦予植物這一類除草劑抗性。”她表示，研究團隊選擇了Trp548Met突變作為目標靶點，該位點突變雖然可通過傳統誘變的方法獲得，但耗時耗力，需要巨大的工作量。而使用基因編輯方法不存在像誘變產生的其他有害突變，沒有脫靶，也無需回交，突變體植株可快速投入應用生產。

研究人員在這一位點將編碼色氨酸的“TGG”密碼子修改為編碼甲硫氨酸的密碼子“ATG”，通過“鉛筆”+“橡皮擦”，同時實現“T到A”和“G到T”的突變。據介紹，這是目前引導編輯外的其他編輯工具所不能實現的。最終他們以高出原始引導編輯器PPE 5.6倍的效率成功獲得了抗除草劑的水稻新材料，并且在甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆兩種除草劑的篩選下有非常好的抗性表型。

“我國雖然在動植物基因編輯技術研發和應用上居于世界前列，但原始ZL嚴重缺位，核心ZL及底層技術大多被美國為首的西方國家壟斷，產業安全面臨嚴重挑戰，加快推動基因組編輯基礎研究是國家發展和戰略布局的迫切需求。”論文共同通訊作者、遺傳發育所研究員曹曉風院士在接受《中國科學報》采訪時曾說。

而新系統的開發有望推動引導編輯在農業育種、作物改良等方面的應用。“我們也期待有更加流暢的‘彩筆’不僅可以實現更長片段的精準改寫，也可以精致的繪制改寫基因組上的修飾，畫出‘彩色’的基因組信息。”劉怡靜說。

植物高效新型引導編輯器ePPE的建立及應用。a-b，原生質體報告系統篩選候選植物引導編輯系統。c，基于刪除RNase H結構域和融合NC蛋白兩種策略構建的引導編輯器與PPE編輯效率對比。d, ePPE示意圖。e，四種不同引導編輯器編輯效率對比。f，ePPE與已報道pegRNA優化策略結合的編輯效率對比。g，ALS-W548M水稻突變體在不同除草劑處理下的表型。作者供圖

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