基因槍轟擊洋蔥表皮觀察GFP瞬時表達

實驗試劑

高滲培養液(MS無機鹽、40g/L甘露醇)，高滲固體培養基(MS無機鹽、40g/L甘露醇、0.7% agar)，無水乙醇，無菌去離子水，12.5 M CaCl2 ，0.1 M亞精胺，等滲培養基(MS培養基)

實驗設備

高速離心機，1.5 ml Ep管，渦旋器，超凈臺，基因槍，氣瓶，激光共聚焦顯微鏡

實驗材料

洋蔥內表皮

實驗步驟

1. OsAGAP瞬時表達載體構建

以5'-CTTCTAGACCA GCC AGG AGA AAT CCA-3’為5’引物(下劃線為引入的XbaI位點)，5'-AAGGTACCAAA TTT CTG AAC GCA GC-3’作為3’引物(下劃線為引入的KpnI位點)進行PCR擴增，將擴增到的片斷克隆到pGFP221上，構成pGFP221-OsAGAP瞬時表達載體。

2. 基因槍轟擊洋蔥表皮觀察GFP瞬時表達

1) 實驗材料準備

撕取洋蔥內表皮，置于高滲培養液(MS無機鹽、40g/L甘露醇)中，室溫100 rpm處理4 hours；然后轉入高滲固體培養基(MS無機鹽、40g/L甘露醇、0.7% agar)。

2) 金粉準備

a. 稱取60 mg金粉放入1.5 ml Ep管(最好為烷硅化的進口管，減少金粉沾壁)；

b. 加入1 ml的無水乙醇，渦旋振蕩1-2 min；

c. 冰上靜置5 min后，10，000 rpm離心1 min，去上清；

d. 重復a，b步驟重新清洗金粉三次；

e. 室溫，10，000 rpm離心1 min，去上清；

f. 加入1 ml無菌去離子水，渦旋振蕩1-2 min，冰上靜置5 min；

g. 室溫，10，000 rpm.離心1 min，去上清；

h. 重復g步聚兩次；

i. 加入1 ml無菌去離子水，按50ul每份分裝到己滅菌的1.5-ml Ep管中備用(分裝時應在無菌條件下邊渦旋振蕩，以保證分裝均勻)

(注：以10槍/3 mg計算，具體實驗可按比例進行換算，無水乙醇清洗處理好的金粉可繼續用無水乙醇中-20℃長時間保存，實驗中金粉沾壁時，最好用超聲波處理，不進行無菌培養的材料可以不需要嚴格的無菌操作)

3) DNA包裹金粉微粒(具體實驗可按比例進行以下操作)

a. 取50ul金粉懸浮液(已分裝好)，在連續渦旋振蕩下按順序加入

5ul質粒DNA (1ug/ul)

50 X12.5 M CaCl2

20 ul0.1 M亞精胺

b. 渦旋振蕩3 min；

c. 室溫下離心10，000 rpm 10 sec，盡可能去凈上清；

d. 加入250ul無水乙醇，渦旋振蕩1-2 min；

e. 室溫下離心10，000 rpm 10 sec，盡可能去凈上清；

f. 加入60ul無水乙醇(可進行4-8次轟擊)。

4) 基因槍轟擊操作(無菌條件下進行)

a. 超凈臺紫外燈滅菌20min；

b. 載體膜、可裂膜、阻攔網等事先置于70%乙醇中1 min，滅菌濾紙上自然風干；將氣瓶調節壓力到1300psi；

c. 取8-9ul已用DNA包裹好的微粒懸浮液加到微粒載體膜中央，稍微晾干后馬上進行轟擊；

d. 將可裂膜、阻攔網、涂有微粒載體膜安裝進固體裝置中，射擊參數為：轟擊微粒運行距離為12cm，壓力1110psi，真空度25mmHg；

e. 轟擊結束后的材料，轉移到等滲培養基(MS培養基)中培養一天一夜；

f. 使用激光共聚焦顯微鏡488nm波長激發下，觀察GFP的表達。