基因克隆的四大要素(FourElementsforGeneCloning)

一、受體細胞 ：

受體細胞的選擇是否合適將關系到能否表達，特別是高效表達。

首先要注意不同的表達載體與受體細胞的關系，即原核表達載體適合原核細胞，真核載體則適合真核細胞，而農桿菌僅適用于植物細胞。即使大腸桿菌質粒，也應注意選擇合適的菌種。例如，當用含有T7 噬菌體啟動子的載體表達外源基因時，由于T7 啟動子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所識別，所以必須使用具有產生T7 RNA 聚合酶能力的受體菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。對于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受體菌，則適合用帶lacZ△M15基因的質粒（如：pUC），以便實現β-D-半乳糖酶α互補，進行藍白斑篩選。

1．選擇受體細胞的一般原則：
①易于接納外源DNA；
②無特異的內源核酸內切酶；
③載體復制、擴增不受阻；
④與載體有互補性。
根據不同的需求，還應考慮：
①表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因型是否匹配；
②遺傳穩定性高，易于進行擴大培養；
③受體細胞內源蛋白水解酶基因確失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表達產物在細胞內積累；
④可使外源基因高效分泌表達；
⑤對動物細胞而言，所選用的受體細胞對培養的適應性強；如：可以進行貼壁或懸浮培養，可以在無血清培養基中進行培養。
⑥受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性；
⑦無致病性；
⑧具有好的翻譯后加工機制等。

2．受體細胞的基因型：
由于野生型大腸桿菌的基因（指沒有發生突變的基因）具有可塑性，為了滿足基因工程中的各種研究或生產的需求，研究人員對它們的基因組進行了改造，使某些基因發生突變或缺失，而引起大腸桿菌的性狀特征（表型）發生變化。通常用基因型（Genotype），或稱為遺傳標記，來描述基因的變異, 野生型加“＋”，突變型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的規則如下：
①根據基因產物或作用產物的英文名稱，取其單詞的第一字母，拼成三個字母并以斜體來表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②變異基因不同，但引起的結果相同，則用作用結果的英文名稱的前三個字母斜體表示，并加上一大寫字母，以示區別。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某個基因缺失時，在該基因型前加“△”。
④由于某個基因變異導致大腸桿菌的特征發生變化，也可以用該特征的英文名來表示，但第一個字母要大寫，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”則表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性標記為amp r, 敏感性為amp- 。

二、實驗過程中菌種的保存和鑒定的重要性

實驗過程中，菌種的保存十分重要，特別是那些經過篩選得到的帶有陽性質粒的菌株。篩選出來的陽性菌株經常需要轉接，而轉接過程一方面要防止污染，同時還要防止質粒的丟失。一個最常用的措施是利用抗生素抑制那些丟失質粒的變異菌落的生長，但實際在菌落生長過程中抗生素會失效，導致雜菌污染而影響質粒的收率或蛋白質的表達量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要時在轉接前對保存菌進行畫線，挑出好的單菌落進行轉接，并再保存一份新的菌種。對這種常規操作不可掉以輕心，否則損失是難以彌補的。

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