現代的SPPs
與早期直徑40μm的填料相比,現代SPP填料體積明顯減小——直徑5.0μm,薄層厚度0.25μm,孔徑300?。顆粒的核心變成堅固的SiO2,表面覆蓋一層薄薄的納米顆粒。這種SPP色譜柱被廣泛用于生物大分子(如蛋白質)的快速分離。生物大分子的擴散系數只有普通小分子的1/10,SPP填料上的薄層能使得這些擴散緩慢的蛋白子分子只在較窄的范圍內滲透(堅硬的核心阻止了其繼續往前擴散)。對比同樣大小的全多孔顆粒,SPP具有較快的遷移速率,同時能在不損失太多柱效的前提下保證較高的流速。圖2a和2b展示了5μm粒徑的全多孔填料與5μm的SPP填料。對于前者,假設物質分子擴散到顆粒的中心位置再返回,整個遷移路徑約為5μm(進出分別為2.5μm)。由于生物大分子的遷移十分緩慢,會導致峰型變寬,這種情況在需要提高流速的快速分離上就更加明顯。

圖2b是同樣粒徑的SPP填料,由于蛋白質分子只需在顆粒外面的薄層進行擴散,其整個遷移路徑只有0.5μm(進出分別為0.25μm)。這一距離只有前面全多孔顆粒的1/10,所以擴散的時間大幅縮短,峰型更尖銳。即使是在高流速下,峰寬仍比全多孔顆粒的填料窄。
從圖3a、b的色譜圖比較可以看出兩者的區別(柱溫:70℃,波長:210nm;峰1:lysozyme;峰2: myoglobin;)。分別對一組蛋白質(lysozyme與myoglobin)在75×2.1mm色譜柱中進行高流速色譜分離。圖3a采用大孔徑(300?)的全多孔硅膠填料,圖3b采用大孔徑(300?)的SPPs填料。對蛋白質一般采用梯度分離,因為等度分離中采用不同填料造成的柱效差異會更大。在梯度分離時,由于SPP填料的柱子具有更快的遷移速率,所以峰型比全多孔填料明顯尖銳。在SPP填料的柱子分離中,很容易觀察到蛋白質lysozyme,即峰1前面有一個不完全分離的雜質峰。將兩種不同填料柱子對應的譜圖在不同流速下做平行比較。同時,當流速提高,兩者的保留時間皆有縮短,梯度時間需做相應調整。
為了更好描述SPP填料的分離效率,圖4展示了8種蛋白質在2.1mm直徑柱子中的快速梯度分離,該過程僅耗時0.75min。

粒徑低于3μm的SPP
上文提及孔徑為300?的SPP填料適用于大分子的快速分離,而近來亞2μm(1.5~1.9μm)填料的發展也使小分子的快速分離得以實現。裝填了亞2μm填料的50mm短柱,其分離時間已少于1min。由于采用粒徑小的填料會造成柱壓增大,有時須用超高壓液相色譜UHPLC。
最近,SPPs再次得到人們的重視。各種新型的SPPs雨后春筍般出現。這些填料顆粒直徑為2.6~2.7μm,外層的多孔層厚度為0.5μm,孔徑90~120?,適用于小分子的分離。相對亞2μm的SPPs填料,此類填料能提供較低的柱子壓降(比前者降低40%~60%),而仍具有較短的擴散路徑等優點。通過特殊的合成工藝,能將SPP微粒粒徑控制在很窄范圍(遠小于全多孔填料微粒)。這樣填料能更有效率地裝填到色譜柱中,也能降低范第姆特方程方程(H=A+ B—u +Cu)式中的參數A(渦流擴散項)。通過同時降低范第姆特方程方程式中的3個參數,這些用粒徑為2.6~2.7μm的SPP裝填的柱子,柱效能媲美亞2μm的SPP柱,能在較低的壓 降下實現高柱效,用戶可繼續使用原來的LC系統,而不必升級到UHPLC了。
此外,利用UHPLC系統也使得我們能通過使用更長的SPP柱子,獲得更大的理論塔板數。圖5對比了使用SPPs填料與亞2μm全多孔填料進行高柱效分離的情況。對比試驗是用裝填上述兩種不同填料的長柱進行的,兩根柱子都有超過10萬的理論踏板數,尺寸皆為55cm×2.1mm,具有基本相同的塔板數和分離時間。經對比發現,兩者最大的不同是柱壓的差別。亞2μm的全多孔填料的柱壓已超過1000bar(15000psi),而粒徑2.7μm的SPP填料柱壓只有547bar(8200psi)。
商業化的現代SPP柱
目前,只有幾家公司能提供適用于大分子和小分子分析的SPP柱子。菲羅門公司除了提供2.6μm粒徑的SPP填料,還推出了1.7μm粒徑規格的填料,該填料在相同的壓降下,能得到比亞2μm全多孔填料更好的分離效率,這對UHPLC系統來說是很大的挑戰。由于SPPs能用于HPLC與UHPLC系統,所以在未來會有更多公司推出此類產品。另外,越來越多針對亞3μm的SPPs填料的固定相也在研發當中,在不久的將來,其固定相的種類能與亞2μm或常規的HPLC全多孔填料相當。
小結
SPP的概念問世已久,而今儼然已成為亞2μm全多孔填料的強勁對手。最新的SPP產品能為大分子和小分子提供快速分離,特別是進行小分子分離時,其壓降比亞2μm的全多孔填料產品要低許多。與亞2μm全多孔填料相比,SPPs具有較厚的微粒薄層,且SPPs填料的可用表面積只下降了25%,由于SPPs顆粒的填充密度高,相同規格的柱子里,SPP擁有的固定相基團數量基本與前者相當的。因此,兩種柱子的樣品容量差距不大。無論是用于小分子分析的2.6~2.7μm粒徑的SPP柱子,還是用于大分子分析的5μm粒徑的SPP柱子,其進出口都采用2.0μm孔徑的篩網密封,因此不易發生堵塞。隨著用戶對這項技術的日益熟悉,SPP填料將有一個美好的前景。