呼吸道感染是人類致病和死亡的最主要原因之一。引起呼吸道感染的病原體種類很多, 包括細菌、病毒、支原體和衣原體等, 尤以病毒多見。無論病因如何, 呼吸道感染的臨床癥狀和體征都很相似, 而不同種類病原體引起的感染, 其治療方法截然不同, 療效和病程也不盡相同。因此, 快速、準確地檢測和鑒別病原微生物有助于臨床進行診斷和治療, 并可用于流行病學的調查及預防性干預措施的制定。
隨著分子生物學技術的迅猛發展, 呼吸道病毒的檢測方法已不再局限于病毒的分離培養和免疫學技術。基因芯片、下一代測序等新興技術已越來越廣泛地應用于呼吸道病毒的快速、靈敏、特異和高通量檢測, 以滿足患者和臨床醫生的需求以及促進新型病毒的發現。本文就呼吸道病毒相關實驗室檢測技術進行綜述。
一、病毒分離培養
病毒分離培養是呼吸道病毒最經典的檢測方法, 亦是診斷的金標準。傳統病毒分離培養法是將處理后的鼻咽分泌物接種于敏感細胞, 用含2%的小牛血清基本培養基(minimum essential medium, MEM)37 ℃旋轉培養, 連續觀察細胞狀態, 一般需1~2周的時間, 不利于疾病的早期診斷和治療, 且部分病毒的分離陽性率很低。上世紀90年代初期, 載玻片培養(shell vial culture, SVC)開始應用于臨床, 將病毒接種在含有蓋玻片的細胞培養瓶中, 經低溫離心后再將蓋玻片進行培養, 隔天使用單克隆抗體染色, 顯影被感染的細胞。SVC將病毒分離培養與特異性單克隆抗體技術結合, 使病毒分離培養檢測時間從過去的8~10 d縮短到1~2 d。由于病毒繁殖具有嚴格的嗜宿主性, 因此病毒分離培養需要根據不同病毒選擇合適的敏感細胞, 如犬腎(Madin-Darby canine kidney, MDCK)細胞最常用于分離流感病毒, 人喉癌上皮細胞(HEP-2)適合培養呼吸道合胞病毒和腺病毒, 鼻病毒和副流感病毒可分別在人二倍體細胞和人胚腎細胞中增殖。傳統采用單細胞培養, 往往要先根據不同流行季節和臨床癥狀推測可能感染的病毒, 再選取敏感細胞, 這樣的操作耗時費力, 因此中外學者研究采用2~3種混合細胞培養方式, 發現不僅拓寬了病毒培養范圍, 而且大大提高了病毒分離率。這種混合細胞培養已有商業化產品應用于臨床, 如Diagnostic HYBRIDS公司基于SVC技術, 通過呼吸道病毒熒光抗體池和使用2種敏感細胞建立的可同時檢測7種常見病毒的R— Mix ReadyCell技術。
二、免疫學技術
直接免疫熒光法是將標有熒光素的抗病毒抗體直接與細胞或組織中的病毒抗原反應。其用時短, 操作簡便, 特異性和敏感性高, 且不需要復雜的操作儀器, 有利于實驗室開展工作, 是現在很多實驗室呼吸道病毒檢測的主流方法。然而該方法要盡量采取患者鼻咽深部的分泌物, 增加了患者的痛苦。
間接免疫熒光法是將特異性抗體先與相應病毒抗原結合形成抗原抗體復合物, 再用熒光標記的二抗與抗原抗體復合物反應, 在熒光顯微鏡下觀察。其優點在于可以同時檢測多種病毒, 但是這種方法敏感性低, 受干擾因素多。
酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)將酶的高效催化作用與抗原抗體反應特異性結合起來, 可檢測呼吸道病毒抗原, 亦可檢測相應病毒抗體, 由于其敏感性高、特異性強、無放射性污染, 是目前應用較廣的一種呼吸道病毒實驗室檢測技術。
三、核酸擴增技術
現已應用于個體呼吸道病毒檢測的核酸擴增技術包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、依賴核酸序列擴增技術(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)、轉錄介導擴增技術(transcription mediated amplification, TMA)、鏈替代擴增反應技術(strand displacement amplification, SDA)、環介導的等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification, LAMP)、滾環擴增技術(rolling circle amplification, RCA)、解鏈酶擴增技術(helicase dependent amplification, HDA)、多重依賴探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)等。 其中多重PCR、HDA、LAMP可以針對多個基因靶點同時檢測2種以上的病毒。
無論患者是否有臨床表征, 高敏感性和高特異性的PCR可以檢測現有報道的所有引起呼吸道感染的病毒。由于多種病毒同時感染并不少見, 且多重PCR成本低, 能在收集樣本后幾小時內得到結果, 是現在最具吸引力的檢測方法。隨著如xTAG?-呼吸道病毒檢測試劑盒(respiratory-virus-panel, RVP)等的多重PCR技術平臺的建立, 多重PCR在不斷地完善和改進。FilmArray是將PCR的嵌套式和多重技術與DNA熔解曲線分析相結合的全自動一體化檢測平臺, 可以在1 h內完成樣本準備、核酸提純、PCR檢測, 整個過程都在密閉管中進行, 基本上沒有污染的風險。此外, FilmArray具有能同時檢測100種不同目標核酸的潛力。徐昌平等[利用雙特異性引物(dual priming oligonucleotide, DPO)技術, 有效避免多重引物的非特異性結合, 既保證了擴增的特異性, 又能提高擴增效率。而將熒光標記應用于目的片段分析的多重實時熒光定量PCR也已在臨床上尤其是在呼吸道病毒的檢測中發揮了重要作用。
BERNING等證實, 與PCR相比, MLPA具有更高的敏感性。針對多重PCR的不足, CHUNG等建立了stuffer-free MLPA-毛細管電泳-單鏈構象多態性(capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism, CE-SSCP)分析法。這一技術去除了MLPA的“ 填充片段” , 簡化了探針設計, 稱之為stuffer-free MLPA; 利用靶向特異性序列進行pre-PCR, 避免了非特異性擴增; 最后應用CE-SSCP將目的片段長度相似的陽性產物分離出來。依據MLPA現已推出了多種呼吸道病毒多重檢測試劑盒, 如RespiFinder-19和RespiFinder-SMART-22。
LAMP與NASBA都是基于病原體核酸的等溫擴增技術。逆轉錄LAMP的檢測下限可低至10個拷貝數。多重LAMP可在30 min內檢測多種病毒及其亞型, 與普通PCR相比敏感性和特異性都高達100%。ZHANG等則首次將多重實時熒光定量與LAMP相結合, 成功應用于8種呼吸道病原體的檢測。NASBA是由禽骨髓母細胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus, AMV)逆轉錄酶、噬菌體T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H催化, 一對特異性引物介導的以RNA為模板的擴增技術, 敏感性顯著高于直接免疫熒光法、快速酶免疫分析法等多種常用方法。
四、芯片技術
芯片技術是研究基因組學、蛋白質組學的有力工具。芯片技術與宏基因組學方法可提供快速病毒鑒定。在數據庫中尋找可用的序列數據設計寡核苷酸探針, 使芯片能在臨床診斷中識別相應的病毒。這種方法可以有助于發現新的病毒, 即使是沒有基因恒定區的病毒也可通過測序獲得檢測結果, 測序加上微陣列芯片則又是一種強大的高通量診斷工具。
由Luminex公司開發的流式熒光雜交(flexible multi-analyte profiling, xMAP?)技術衍生的液相芯片技術是一種新型生物技術平臺。液相芯片由大小均一的圓形微球構成, 微球上固定帶有相應熒光標記的不同分子探針, 最后通過熒光信號的檢測判定結果。
“ Virochip” 就是一個泛病毒芯片, 由22 000條長寡核苷酸探針組成, 可同時檢測幾乎所有已知的病毒, 并且與常規檢測方法比較, 具有相當或更高的敏感性和特異性。與其相似的還有流感病毒芯片— — FluChip-55 microarray, 專為快速檢測流感病毒A及其各亞型(H1N1、H3N2和H5N1等)而設計。
蛋白芯片可應用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-核酸、蛋白質-配體相互作用的研究, 能夠分析免疫反應, 對于診斷和生物標志物的發現都很重要。蛋白芯片還可以作為一種快速、靈敏、簡單的工具, 用于大規模檢測血清中病毒特異性抗體。2002至2003年重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)流行期間, 采用冠狀病毒蛋白質芯片篩選人血清(> 600個血清樣本), 發現其準確性> 90%, 且特異性高于ELISA。因此, 蛋白芯片是未來病毒感染流行病學研究的一個潛在的強大工具。
五、下一代測序技術
從2005年開始, 下一代測序在很短的時間內以其多樣本、高通量、多功能的特點從根本上徹底改變了基因組學領域, 使之前由于技術缺陷而無法進行的試驗都能得以開展。在過去的5年里, 下一代測序一直應用于新病毒的發現, 許多病毒和菌株用這種方法被鑒別出來, 包括2013年新發現的副流感病毒4。下一代測序具有令人難以置信的敏感性, 它可以同時檢測多個患者樣本, 確定特定病原體和病毒抗性, 以確保患者得到適當的治療。雖然與經典Sanger測序相比, 從單個堿基層面上來看下一代測序具有價格優勢, 但是對于單個反應來說仍顯得昂貴, 且大多數臨床實驗室對這項技術還沒有足夠的需求和認知。此外, 樣本的制備到數據獲得一般需要2~3 d, 一個反應所產生的大量數據還需要有經驗豐富的專業型生物信息學人員進行分析。當然這些限制將來一定能得到完善, 最終下一代測序技術將會在呼吸道病毒分子診斷中發揮重要作用。
六、質譜(mass spectrometry, MS)分析技術
MS可以提供豐富可靠的核酸、蛋白甚至完整的病毒序列信息, 已成為病原體分子診斷的另一種選擇。MS可以與各種色譜分析、親和技術以及其他分子診斷技術結合應用, 可大大提高其檢出限。如基于親和素法, 與納米技術結合, MS可以檢測痕量靶向病原體。病原體核酸PCR擴增也可與MS相結合作為替代方法。MS具有同時快速檢測多種病毒, 甚至是識別蛋白修改位點的優勢。現在MS不僅僅用于蛋白質組學分析, 在基因組學中的應用更是越來越普遍。現有的MS類型多種多樣, 用于病原體分析的MS類型有基質激光解吸離子化質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS)、表面增強激光解吸離子化質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry, SELDI-MS)、生物氣溶膠(bioaerosol mass spectrometry, BAMS)、裂解氣相色譜質譜(pyrolysis gas chromatography mass spectrometry, Py/GC/MS)、毛細管電泳質譜(capillary electrophoresis-mass spectrometry)以及液相色譜質譜(liquid chromatography mass spectrometry, LCMS)等, 其中實踐運用效力最強的是電噴霧質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)。SAMPATH等利用逆轉錄PCR融合ESI-MS技術對1999至2006年間的656例臨床患者呼吸道樣本進行了分析, 正確檢測出92種哺乳動物和禽流感分離病毒, 敏感性和特異性均高達97%。同時在這656例樣本中還發現了大約1%的病例含有混合病毒變異株, 這使得人類對病毒進化有了更深一步的了解。逆轉錄PCR融合ESI-MS技術平臺的優勢不僅可以對病原體定量, 并且能高效高敏感性地檢測多種病毒。
七、其他技術
1. 納米技術 最新的納米技術為科學研究又開啟了新的發展方向和視角。當物質縮小到納米級別, 物質屬性發生變化, 納米技術利用這些新的屬性與現有技術結合, 發揮特殊功能。
免疫PCR是ELISA與PCR的結合, 廣泛應用于多種細菌和病毒的檢測。PEREZ等使用金標納米顆粒改進免疫PCR來檢測呼吸道合胞病毒, 其檢出下限可達到4.1 pfu/mL, 敏感性比ELISA高出4 000倍。
如果活細胞成像具有鑒別、量化細胞內生物分子的能力, 那么就會大大有利于疾病的診斷和治療。然而建立這種病毒檢測體系相當困難, 尤其是在感染早期階段。但是隨著分子標記技術的問世, 追蹤活細胞內mRNA已成為可能。以此為基礎, 金納米顆粒通過巰醇基與DNA發卡結構相連, 形成金納米顆粒寡核苷酸探針。DNA環形部分是目標RNA的互補序列, 5'端與金納米顆粒相連, 3'端連接一個熒光基團。當DNA環形部分與靶RNA雜交時, 熒光基團離開金納米顆粒而發出熒光, 從而使mRNA成像成為可能。JAYAGOPAL等已使用這種發卡DNA金納米顆粒在HEp-2細胞中成功檢測呼吸道合胞病毒mRNA。
2. 表面增強拉曼光譜術(surface-enhanced raman spectrometry, SERS) 與紅外光譜相比較, 拉曼光譜可以避免水分子的干擾, 從物質的天然構象進行生物學分析。即使是對細胞中的單個分子, SERS都具有高特異性、高敏感性和高精確性, 并且以快速無損的形式進行檢測。SERS能以DNA、RNA、蛋白以及其他有機化合物為檢測目標, 分析核酸的堿基序列和組成以及蛋白或配體等分子間的相互作用, 它可以區分DNA和RNA病毒, 分析不同樣本來源的細菌和病毒。
八、總結與展望
傳統的呼吸道病毒檢測的臨床樣本為血液或咽拭子分泌物等, 采集方法為侵入式, 容易造成患者的痛苦, LIU等用實時PCR檢測巨細胞病毒, 比較尿液與咽拭子樣本巨細胞病毒DNA拷貝數, 發現兩者差異無統計學意義。可見未來呼吸道病毒檢測不僅可以從技術上不斷革新, 還能從樣本來源考慮, 盡量做到無創檢查, 將患者可能受到的傷害降到最低。
呼吸道病毒是呼吸道感染最重要的病原體之一, 隨著抗病毒藥物的廣泛應用, 越來越多的病毒對抗感染的一線藥物產生耐藥性, 且近年來不斷有新發病毒威脅著全人類的健康, 而快速、靈敏、特異的檢測方法有助于疫情暴發流行的控制和防止藥物的濫用。傳統呼吸道檢測依賴于免疫熒光和組織分離培養, 雖然組織分離培養為金標準, 但是檢測時間需要幾天甚至幾周, 因此其結果很難用于臨床治療的指導。免疫熒光由于其可快速檢測, 在幾個小時內得到結果, 現已作為臨床常規方法。目前, 分子檢測技術以其高靈敏、高特異、快速的特點日漸成熟。除了上述介紹的方法外還有測流免疫技術(lateral flow immunoassay, LFIA)、流式細胞術等多種新興檢測技術正蓬勃發展, 檢測手段也不再局限于一兩種方法, 而是多種技術聯合應用, 發揮各自的特點, 如低成本的多重PCR技術或新型核酸擴增技術搭載MS、芯片等高通量平臺是目前最具有發展前景的病毒檢測方法。以上很多技術都已獲得認證, 可進入臨床試驗, 如xTAG?-RVP是美國食品藥品管理局(the Food and Drug Administration, FDA)認證的第1個呼吸道病毒多重檢測試劑盒, xMAP?技術則是第1個被FDA認證可用于臨床診斷的生物芯片技術, FilmArray分子診斷平臺和基于納米金顆粒技術的檢測試劑盒也通過了FDA的臨床診斷審批, 基于ESI-MS技術開發的PLEX-IDTM系統和RespiFinder多重呼吸道病原檢測試劑盒則都已獲得歐盟認證。而另一些技術如下一代測序技術、基因芯片技術等雖然應用前景廣闊, 但由于還無法完全適應臨床需求, 目前僅局限于實驗室科研探索中。未來這一領域勢必向低成本、小設備、快速、高通量和全自動一體化檢測的方向發展。