含有RecA的目標片段經T4DNA聚合酶處理后的SLIC亞克隆

實驗概要

SLIC(Sequence and Ligation Independent Cloning)是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法，它可以實現體外同源重組反應中多個DNA片段在單一反應中的裝配和單鏈的退火。

實驗步驟

1．用限制性內切酶處理2微克載體，使用QIAEX II凝膠提取試劑盒純化載體并分離DNA，對載體進行定量。

2．使用Taq  DNA聚合酶擴增片段，設立100μL 的PCR反應體系：250μM dNTP ，0.5 μM 引物和 2.5 U Taq  DNA聚合酶(Eppendorf公司)。周期如下：94°C 45秒，(94°C 45秒，54°C 45秒，72°C 1分鐘，30周期)；  72°C 10分鐘，PCR擴增后加入20U Dpnl 至100μL  PCR產物，37°C孵育1小時(不是必要的，如果從MAGIC載體至ColE1來源)。通過QIAquick  PCR純化柱純化PCR產物。定量目標片段，在目標片段與載體之間，通常有20 bp的同源性。

3．取1μg載體和1μg的目標片段，分別用含BSA的 T4緩沖液(NEB)的0.5U的T4DNA聚合酶室溫處理30分鐘，加入10 mM 1/10體積的dCTP終止反應，置于冰上。

4．設立10μL退火反應，插入蛋白和載體的比率1:1，用3 ng或3.1 kb的載體(0.0015 pmol)，1×緩沖液(NEB)，適量的目標片段，20 ngRecA蛋白和水。在37°C孵育30分鐘。置于冰上或-20°C儲存。

5．加入5μL退火混合物到150 μl BW23474化學感受態細胞，冰上孵育30分鐘，42°C熱休克45秒，重置冰上2分鐘，加入0.9毫升的SOC， 37° C，反應1小時。

6．加入100μL適當濃度的抗生素，37°C過夜。(以Cl-Phe為載體，因為酶切位點之間有Phs-G294。我們發現，在預反應階段大多數背景信號來源于未酶切的載體，因此，我們可以用Cl-Phe作載體。但Cl-Phe不是必須的步驟，通常對背景信號只有2倍的效果。)