反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質為固定相,極性有機溶劑的水溶液為流動相,根據溶質極性(疏水性)的差別進行溶質分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣,RPC中溶質也通過疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋,表現出強烈的疏水性。因此,必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質的洗脫分離。
溶質在反相介質上的分配系數取決于溶質的疏水性,一般疏水性越大,分配系數越大。當固定相一定時,可以通過調節流動相的組成調整溶質的分配系數。RPC主要應用于相對分子質量低于5000,特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化,也可以用于蛋白質等生物大分子的分析和純化。由于反相介質表面為強烈疏水性,并且流動相為低極性的有機溶劑,生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活,所以,以回收生物活性蛋白質為目的時,應注意選用適宜的反相介質。