雙三元液相色譜DGLC

樣品前處理是HPLC分析中必不可少的一部分，常需手工且需多步操作才能完成，要比HPLC分離和數據處理等花費更多的時間。其作用是去除試樣中的干擾物質，使痕量組分得到富集，便于檢測和分離，且不損害色譜柱。因此，在分析方法的建立和常規分析中，方法的精密度和準確性很大程度上取決于樣品的前處理操作。

近年來，隨著液相色譜儀技術的迅速發展，HPLC自動化程度越來越高，加之色譜柱顆粒技術的發展，使得色譜分離的時間大大縮短。無疑，樣品的前處理技術實現自動化，將會為實驗室人員帶來極大的益處。尤其是當面臨大量樣品且前處理過程繁瑣時，自動化無疑是理想的選擇，這也與HPLC技術發展相匹配。固相萃取是當前常用的樣品前處理技術，分為在線和離線兩種方式，用于樣品的凈化、除雜和富集。離線固相萃取具有試劑用量少、節省時間、易于SOP 等優點。其缺點為SPE固相萃取柱僅能使用一次，成本較高。而在線固相萃取技術(online SPE)能把活化、平衡、除雜和洗脫等過程在封閉系統內自動化完成，減少人工操作帶來的誤差，提高方法的準確性和精密度，不僅能加快樣品的前處理過程，而且SPE柱可重復使用，總的分析成本將大大降低;更為關鍵的是在線SPE柱(dp5~10μm)比離線SPE萃取管柱效更高，分離度更好，樣品更干凈，更易于最終的HPLC分離。

傳統實現online SPE的過程如圖1所示，常需另外添加一個輸液泵，系統連接復雜，靈活性和自動化程度較差。賽默飛UltiMate 3000雙三元液相色譜，采用獨特的雙泵設計，每個泵可作為一個單獨的體系，有各自獨立的比例閥和流動相體系，可同時單獨控制三種不同的流動相，在Chromeleon變色龍軟件的支持下，結合獨特的閥切換技術，通過靈活的流路連接設計，一套系統即可以輕松實現online SPE以及HPLC分離過程。見圖2.

在線固相萃取技術的痕量組分富集應用

飲用水中9種有機物(微囊藻毒素-LR、呋喃丹、甲萘威、百菌清、莠去津、溴氰菊酯、2,4,6-三氯酚、五氯酚和苯并芘)的分析比較復雜，對很多實驗室的工作人員來說具有很大的挑戰性。國標方法GB/T 5750需要復雜的樣品前處理流程，如水體的富集，但使用賽默飛的雙三元(DGLC)液相色譜，一套系統輕松搞定水體的富集、凈化、分離與檢測，不僅精簡了飲用水的前處理操作，大大簡化了國標方法的復雜性，而且很容易實現飲用水標準檢驗方法的檢出限要求，使得在飲用水水質控制方面更加簡單易行。同時在普及性極高的HPLC-UV-FLD儀器上實現了高靈敏度檢測，可作為監測飲用水體檢測上述有機物的常用方法。

圖3 在線固相萃取-雙三元液相色譜分析原理圖

(A：上樣，清洗，萃取;B：洗脫，分離，分析)

在線固相萃取技術的復雜樣品凈化應用

在線固相萃取技術的色譜柱切換法是分離和清除復雜多組分樣品雜質的有效技術，可被用于去除強保留的、對色譜柱造成損壞的雜質，又可除去干擾色譜分離的物質。黃芪是常見的中藥，也是中藥方劑配伍及其制劑中使用頻率較高的中藥。其中黃芪甲苷是主要活性成分，藥品標準中常將其作為質量評價指標成分。但黃芪甲苷含量較低，且黃芪基質復雜。2010版一部藥典中，黃芪藥材的前處理采用正丁醇萃取，經過D101大孔吸附樹脂離線純化后，再進樣分析，步驟較多，回收率不高。利用賽默飛雙三元液相色譜系統，采用在線固相萃取技術的柱切換凈化方法結合電霧式檢測器檢測，對樣品進行凈化后再自動切換到分析柱上進行分析，取得了很好的結果。已成功應用于黃芪藥材、歸脾丸(濃縮丸)，補腎固齒丸，益氣養血口服液和頸復康顆粒等中藥復方樣品的分析中。系統連接方式見圖5.

圖7 黃芪及其復方分離譜圖

結合限制性介質材料(RAM)柱和Turboflow技術，提高生物樣品分析效率

限制性介質材料(RAM)柱同時具有對大分子的體積排阻作用和對小分子的吸附作用，通過控制吸附劑合適的孔徑和對吸附劑的外表面進行適當的生物兼容性修飾，使得生物樣品中的大分子基質成分不能進入吸附劑的內孔中去，且生物兼容性的外表面保證了生物大分子不會發生不可逆的變性和吸附，這樣大分子物質在死體積或近于死體積的情況下被洗脫除去。而Turboflow技術是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產生渦流狀態，在渦流狀態下，溶質分子傳質加快，傳質阻力減小，雖然其流速很高，但分離效率并沒有隨之降低很多。在這種情況下，大分子的基質成分如蛋白質等，還未能擴散進入填料顆粒內部就已被洗出柱外，而小分子的待測物則可以保留下來，與基質分離。

在用大鼠進行抗高血壓聯合用藥氫氯噻嗪和尼群地平的藥代動力學實驗中，每次取血量有限，且血藥濃度較低，要求最好可同時測定氫氯噻嗪和尼群地平。此兩種藥物同時檢測的分析方法報道很少，多數是對兩藥分別建立分析方法。原因有兩個：一、尼群地平口服吸收存在首過效應，體內血藥濃度值低，大約1-50 ng/mL，在這個檢測濃度條件下，多采用液質聯用技術進行分析，而此兩種藥物在質譜工作條件下一個是正離子模式，一個是負離子模式，同時檢測不方便;二、尼群地平和氫氯噻嗪極性相差較大，同時提取和分析困難較大。

利用賽默飛雙三元液相色譜系統(DGLC)的online SPE技術結合紫外檢測器，采用限制性介質材料(RAM)柱CAPCELL MF C8作為在線固相萃取柱。血漿樣品于4℃下，10000 r/min高速離心后，取上清液，用0.22 μm尼龍濾膜過濾，直接進樣分析，可在線去除血漿中的蛋白,又可同時對尼群地平和氫氯噻嗪進行測定，避免了樣品前處理手動操作帶來的誤差，且樣品基質干擾少，適合對血漿樣品定量分析。此分析方法不僅提高了生物樣品的分析效率，而且可以為進一步的藥代動力學-藥效學聯合模型的建立提供有力支持。

圖8-1 氫氯噻嗪(3.3 ppm) 圖8-2 尼群地平(3.3 ppm)
 

圖9-1 大鼠血漿中氫氯噻嗪圖9-2大鼠血漿中尼群地平

上面這些應用實例展現了賽默飛UltiMate 3000雙三元液相色譜在線固相萃取技術的多樣化應用以及簡便、實用、高效的特點。此外，基于靈活的閥切換技術，可以通過并聯多柱模式實現高通量的online SPE過程，同時可以針對基質成分和目標物的理化性質，靈活選擇多種不同的化學鍵合相的SPE柱，在Chromeleon變色龍軟件支持下，解決實際工作中的分析難題。目前賽默飛UltiMate 3000雙三元液相色譜在線固相萃取技術已廣泛應用于環境化學、食品飲料、藥物臨床研究等領域。