過去幾年里，單細胞蛋白質組學技術取得了長足發展，單細胞蛋白質組學逐漸走向成熟，后續有望廣泛應用于腫瘤異質性分析、免疫學研究、發育生物學、神經科學以及精準醫學等領域。然而，從技術發展成熟到實際場景應用分析的過程中，我們仍面臨諸多挑戰：1.當前單個細胞的蛋白鑒定深度還有待進一步提升以更好回答科學問題；2.在實際應用場景中，單細胞狀態及尺寸往往比實驗室培養分選出來的單細胞要更差更小，更加考驗整套流程方案可操作性和穩定性、儀器抗背景污染、靈敏度等實際性能；3.單細胞蛋白量少，如何確保最終鑒定蛋白的可靠性和準確性，對于后續真實反映生物學問題和臨床需求至關重要。關于這些實際問題的探索，將有效推動單細胞蛋白質組學技術的發展以及在實際應用中的潛力和價值。
布魯克長期關注單細胞蛋白質組領域前沿技術進展和需求，經歷前期兩代單細胞質譜平臺的技術積累和經驗，在2024年的ASMS大會上，布魯克發布了第三代“真”單細胞蛋白質組學質譜平臺 timsTOF Ultra 2，進一步提升實際應用場景分析靈敏度和高達300Hz掃描速度，成為破解單細胞蛋白質組學強有力的武器。布魯克第三代“真”單細胞蛋白質組學解決方案基于CellenOne進行單細胞分選，搭配標準的384孔板作為載體進行單細胞樣品前處理，可與 nanoElute 2 納升液相無縫連接，直接上樣進行色譜分離，后續在超高靈敏度和超快掃描速度的 timsTOF Ultra 2 上進行分析，結合實時數據檢索軟件ProteoScape?，實現單細胞蛋白質組學全流程方案。
所見即所得 ————————
布魯克上海 Demo 實驗中心 timsTOF Ultra 2 完美重現官方宣傳數據，293T細胞消化液梯度稀釋樣本分析結果顯示，21 分鐘的分析時長，當樣本量為 250pg（相當于單個人源細胞蛋白質總量）時，可鑒定近 6700 種蛋白質，對應超過5.5萬條多肽。這一出色表現為單細胞及痕量蛋白質組學研究奠定了堅實的基礎。同時可以發現僅需 16.125pg 的樣本，即可鑒定超過 3000 種蛋白質，對應超過1.5萬條多肽，極致靈敏度不僅支持常規單細胞分析，更能有效滿足對小型免疫細胞、外周血單核細胞及亞細胞器等超微量樣本的研究需求。
圖2：上海Demo實驗中心293T細胞消化液實測結果
“真”
單細胞分析 ————————
基于布魯克第三代成熟且可復制的單細胞蛋白質組學解決方案，在上海Demo實驗中心完成了培養細胞的分選，共制備了25個尺寸20-25μm的293單細胞樣本，僅用21分鐘的色譜梯度，在單個細胞水平上成功鑒定出超過6000種蛋白質和超過5.4萬條多肽，顯著提升鑒定深度，展現了對單個細胞的深度覆蓋能力。
圖3：293單細胞分析結果
“實”際多場景
真單細胞分析 ————————
實際樣品分析相比標準培養細胞系面臨更多挑戰，實際場景中往往面臨細胞的稀缺性、更復雜的基質背景體系和偏小的細胞尺寸等。為了評價 timsTOF Ultra 2 實際應用場景分析性能，選取了兩種極具代表的單細胞應用場景：組織中提取的干細胞和更小的免疫細胞。
（1）肌肉干細胞在促進肌生成和抵抗衰老方面發揮著重要作用，可以為理解肌肉衰老機制和肌肉再生治療提供獨特視角。我們成功分析了10個直徑為10-15μm的小鼠肌肉組織提取的肌肉干細胞， 15分鐘分析時長下，單個小鼠肌肉干細胞成功鑒定出超過4100種蛋白質和30000條多肽，包含多種干細胞標志蛋白。
圖4：“實”際多場景下單細胞分析結果
“準”確可靠
單細胞分析 ——————————
單細胞含蛋白量少，很容易引起質譜譜圖質量差和多肽鑒定數目偏低的問題，從而造成鑒定蛋白的可靠性和準確性低。有報道表明，雖然單條肽段匹配即可鑒定一種蛋白質，但通過同一蛋白的第二條和其它多條肽段進行驗證，可有效確證初次鑒定，大幅提升統計置信度。多肽段共同指向同一蛋白的策略能有效排除錯誤鑒定，顯著提高鑒定結果的可信度（Zhang, Y. et al. Journal of Proteomics 2015）。因此，實驗最后統計了實測數據中不同來源單細胞樣本中每個蛋白對應多肽情況，可以發現基于 timsTOF Ultra 2 平臺測試結果中，每個蛋白質平均由7~8條多肽匹配鑒定，超過50%鑒定蛋白對應鑒定多肽大于3條。這一特性為蛋白質的可靠鑒定和準確定量奠定了堅實基礎，通過多肽段的高覆蓋，可有效增加結果的可靠性。同時，也使得其非常適合肽組學、免疫肽組學以及一些未知蛋白發現鑒定分析。
圖5：不同單細胞樣本中單個蛋白對應的肽段數目統計
總的來說，基于 timsTOF Ultra 2 的單細胞質譜平臺不僅能夠在真正單個細胞中實現蛋白質組的深度覆蓋，還在面對復雜實際分析場景時展現出卓越且穩定的分析性能。同時，單細胞水平上每個蛋白鑒定平均對應多條肽段的指認策略，大幅提升了結果的可信度。兼顧“真實準”，三駕馬車并駕齊驅的4D-單細胞技術將為單細胞蛋白質組學的“真實”世界場景分析和應用轉化提供強有力的支持，挖掘出更豐富的生物信息，為生命科學領域的研究與創新開辟全新的可能。
參考文獻：
1. Single-cell proteomics: challenges and prospects. Nature Methods 20, 317-318 (2023).
2. Lee, S., et al. Advances in Mass Spectrometry-Based Single Cell Analysis. Biology 12, 395 (2023).
3. Brunet, A., et al. Ageing and rejuvenation of tissue stem cells and their niches. Nature Reviews Molecular Cell Biology 24, 45-62 (2023).
4. Klebanoff, C.A., et al. T cell receptor therapeutics: immunological targeting of the intracellular cancer proteome. Nature Reviews Drug Discovery 22, 996-1017 (2023).
5. Zhang, Y., et al. ProteinInferencer: Confident protein identification and multiple experiment comparison for large scale proteomics projects. Journal of Proteomics 129, 25-32 (2015).
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