化學測序法實驗

發布時間：2019-09-10 10:50 原文鏈接：化學測序法實驗

試劑、試劑盒	醋酸無水乙醇硫酸二甲酯 DMS DMS 緩沖液 DMS 終止液 EDTA 甲酰胺甲酰胺上樣緩沖液肼肼終止液 NaCl NaOH-EDTA 溶液哌啶水溶液哌啶甲酸乙酸鈉聚丙烯酰胺測序凝膠鮭魚精 DNA 放射標記的目標 DNA 酵母 tRNA
儀器、耗材	干冰-乙醇浴切侖科夫（Cerenkov) 記數器冰水浴小離心管旋轉真空干燥器有緊固蓋的循環水浴裝置凝膠測序裝置及電源可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置
實驗步驟	材料溶液和緩沖液貯存液、緩沖液和試劑的配方請參照附錄 1。醋酸（1mol/L): 用冰醋酸（17.4mol/L) 現配無水乙醇：-20°C 硫酸二甲酯（DMS): 濃度 99%(Aldrich; 金色標簽 99%) DMS(10%V/V) 溶于乙醇中 DMS 緩沖液 50 mmol/L 二甲基砷酸鈉（pH7.0) 1 mmol/I.EDTA(pH8.0) 警告：稱量二甲基砷酸鈉時使用手套和面具，使用 DMS 緩沖液時使用手套。 DMS 終止液 1.5mol/L 乙酸鈉（pH7.0) 1mol/Lβ-巰基乙醇 250ug/ml 酵母 tRNA EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 甲酰胺甲酰胺上樣緩沖液肼（95%) 肼（EastmanKodak), 分裝成小份，置于緊密封口的微量離心管中，保存干-20°C。肼終止液 0.3mol/L 乙酸鈉（pH7.0) 0.1 mmol/LEDTA(pH8.0) 100ug/ml 酵母 tRNA NaCl(5mol/L) NaOH-EDTA 溶液：1.2mol/LNaOH 含 1 mmol/LEDTA 1mol/L 哌啶水溶液應新鮮配制，在刻度玻璃管中用 1 倍體積哌啶（10mol/L;Fisher) 混合 9 倍體積水。 1mol/L 哌啶甲酸用 10mol/L 哌啶將 4% 甲酸水溶液調至 pH2.0 即可， 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 膠聚丙烯酰胺測序凝膠 Maxam-Gilben 測序反應產物通常在 6% 或者 8% 的變性聚丙烯酰胺凝膠上分析（請參考方案 8)。梭酸和寡梭苷酸鮭魚精 DNA(lmg/ml) 水溶液修剪的鮭魚精 DNA 通常被用來作為化學測序的載體。事實上，幾乎所有 DNA 都可以。而修剪的鮭魚精 DNA 可以作為商品買到，同時也可以在實驗室中得到（見第 6 章，方案 10) 放射標記的目標 DNA 標記的片段必須包括最少 5x10⁵Ci/min 的 ³²P, 溶于水中可至 5000Ci/min/ul(細節請見補充方法：制備化學測序中的末端標記 DNA)。DNA 溶液必須無鹽。如果放射性標記的 DNA 有限. 有時可以只進行 5 反應流程中的 4 個（C、C+T,A+G、G) 就得到序列結果。酵母 tRNA(1 mg/ml 水溶液）特殊裝置干冰-乙醇浴切侖科夫（Cerenkov) 記數器（見附錄 8) 冰水浴小離心管切割反應通常在標準 1.5 ml 小離心管中進行。當同時進行不同實驗時，可用不同顏色的管以區分。有些研究者使用硅處理過的管。其實這一措施并不必要，只需在每步沉淀后都將 DNA 徹底溶解即可。例如，可用 Tip 頭吸取緩沖液徹底沖洗管壁，或延長渦旋振蕩的時間。旋轉真空干燥器如 SavantSpeedVac。有緊固蓋的循環水浴裝置例如 ResearchProductsInternational 產品。選用，見第 4 步。凝膠測序裝置及電源參見方案 11。可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置方法 1. 準備好放射性標記的DNA, 依表12-16的流程圖操作。通常只進行流程中的4個反應（C,C+T,A+G,G)就可得到序列結果。 2. 在以上4或5個包含修飾堿基的凍干的DNA樣品中加入100ul 1mol/L哌啶，用渦旋振蕩器重懸。哌啶用來切斷DNA鏈上化學修飾位點的糖-磷酸鍵。 3. 蓋嚴管口，用渦旋振蕩器混勻。如果需要，稍離心（2000r/min)使混合物聚集于管底。 4.90°C孵育30 min。為防止管蓋彈開，可以在管上壓上重物，或用塑料膠帶封住管口, 或在有緊固蓋的循環水浴裝置中反應。 5. 等管冷卻到室溫，打開蓋子，用石蠟膜（Parafilm)封上打開的管子，用21號針頭在石蠟膜上刺幾個孔。在旋轉真空干燥機上將其抽干。為避免最后的測序膠上條帶模糊不清，必須徹底去除堿基持異切割反應中的哌啶。最好在凍干的情況下使用旋轉真空干燥機。依抽干機效率而言，此步常需要1~4小時。一些研究者傾向于在抽干前用干冰-乙醇溶冷凍樣品。 6. 取出小管。去除石蠟膜并加入20ul水。蓋上管蓋，渦旋振蕩30s溶解DNA。稍離心使溶液聚集在管底。使用手持微型計數器計數以確認管壁上的標記DNA已經完全被溶解在了水溶液中。 7. 重復一次，在旋轉真空干燥機上將其抽干，這一步依抽干機效率常需要15~30 min。 (參照第5步）。 8. 重復步驟6和7。為了確保哌啶被完全除去. 一些研究者傾向于再次將DNA溶于10ul水并抽干。可是, 一般而言，只有在樣品呈油狀或者需要很長的抽干時間時才需要進行這一步。 9. 用切侖科夫（Cerenkov)記數器估計管中的放射活性，把修飾并切割后的反應物于測序膠緩沖液中。在柯達XAR-5膠片上的過夜曝光時，在一個堿基之后的切割反應物需要大約25000cpm(C和G 反應），在兩個堿基之后的切割反應物需要大約50000cpm(C+T，A+G,A>G)。所以，溶解在測序緩沖液中的C和G反應物要達到25000cpm/3ul; 而C+T,A+G和A>G反應物要達到 50000cpm/3ul。渦旋混合物使 DNA 完全溶解，稍離心使混合物聚集于管底。樣品可在-20°C 保存數小時。 10. 在 90°C 加熱 lmin 使 DNA 變性，在冰上驟冷。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果（參見方案 8，9,10,11 和 12)。展開

試劑、試劑盒

醋酸無水乙醇硫酸二甲酯 DMS DMS 緩沖液 DMS 終止液 EDTA 甲酰胺甲酰胺上樣緩沖液肼肼終止液 NaCl NaOH-EDTA 溶液哌啶水溶液哌啶甲酸乙酸鈉聚丙烯酰胺測序凝膠鮭魚精 DNA 放射標記的目標 DNA 酵母 tRNA

儀器、耗材

干冰-乙醇浴切侖科夫（Cerenkov) 記數器冰水浴小離心管旋轉真空干燥器有緊固蓋的循環水浴裝置凝膠測序裝置及電源可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置

實驗步驟

材料

溶液和緩沖液

貯存液、緩沖液和試劑的配方請參照附錄 1。

醋酸（1mol/L): 用冰醋酸（17.4mol/L) 現配

無水乙醇：-20°C

硫酸二甲酯（DMS): 濃度 99%(Aldrich; 金色標簽 99%)

DMS(10%V/V) 溶于乙醇中

DMS 緩沖液
50 mmol/L 二甲基砷酸鈉（pH7.0)
1 mmol/I.EDTA(pH8.0)
警告：稱量二甲基砷酸鈉時使用手套和面具，使用 DMS 緩沖液時使用手套。

DMS 終止液
1.5mol/L 乙酸鈉（pH7.0)
1mol/Lβ-巰基乙醇
250ug/ml 酵母 tRNA

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

甲酰胺

甲酰胺上樣緩沖液

肼（95%)
肼（EastmanKodak), 分裝成小份，置于緊密封口的微量離心管中，保存干-20°C。

肼終止液
0.3mol/L 乙酸鈉（pH7.0)
0.1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100ug/ml 酵母 tRNA

NaCl(5mol/L)

NaOH-EDTA 溶液：1.2mol/LNaOH 含 1 mmol/LEDTA

1mol/L 哌啶水溶液
應新鮮配制，在刻度玻璃管中用 1 倍體積哌啶（10mol/L;Fisher) 混合 9 倍體積水。

1mol/L 哌啶甲酸
用 10mol/L 哌啶將 4% 甲酸水溶液調至 pH2.0 即可，

3mol/L 乙酸鈉（pH5.2)

膠

聚丙烯酰胺測序凝膠
Maxam-Gilben 測序反應產物通常在 6% 或者 8% 的變性聚丙烯酰胺凝膠上分析（請參考方案 8)。

梭酸和寡梭苷酸

鮭魚精 DNA(lmg/ml) 水溶液
修剪的鮭魚精 DNA 通常被用來作為化學測序的載體。事實上，幾乎所有 DNA 都可以。而修剪的鮭魚精 DNA 可以作為商品買到，同時也可以在實驗室中得到（見第 6 章，方案 10)

放射標記的目標 DNA
標記的片段必須包括最少 5x10⁵Ci/min 的 ³²P, 溶于水中可至 5000Ci/min/ul(細節請見補充方法：制備化學測序中的末端標記 DNA)。DNA 溶液必須無鹽。如果放射性標記的 DNA 有限. 有時可以只進行 5 反應流程中的 4 個（C、C+T,A+G、G) 就得到序列結果。

酵母 tRNA(1 mg/ml 水溶液）

特殊裝置

干冰-乙醇浴

切侖科夫（Cerenkov) 記數器（見附錄 8)

冰水浴

小離心管
切割反應通常在標準 1.5 ml 小離心管中進行。當同時進行不同實驗時，可用不同顏色的管以區分。有些研究者使用硅處理過的管。其實這一措施并不必要，只需在每步沉淀后都將 DNA 徹底溶解即可。例如，可用 Tip 頭吸取緩沖液徹底沖洗管壁，或延長渦旋振蕩的時間。

旋轉真空干燥器
如 SavantSpeedVac。

有緊固蓋的循環水浴裝置
例如 ResearchProductsInternational 產品。
選用，見第 4 步。

凝膠測序裝置及電源
參見方案 11。

可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置

方法

1. 準備好放射性標記的DNA, 依表12-16的流程圖操作。
通常只進行流程中的4個反應（C,C+T,A+G,G)就可得到序列結果。

2. 在以上4或5個包含修飾堿基的凍干的DNA樣品中加入100ul 1mol/L哌啶，用渦旋振蕩器重懸。
哌啶用來切斷DNA鏈上化學修飾位點的糖-磷酸鍵。

3. 蓋嚴管口，用渦旋振蕩器混勻。如果需要，稍離心（2000r/min)使混合物聚集于管底。

4.90°C孵育30 min。為防止管蓋彈開，可以在管上壓上重物，或用塑料膠帶封住管口, 或在有緊固蓋的循環水浴裝置中反應。

5. 等管冷卻到室溫，打開蓋子，用石蠟膜（Parafilm)封上打開的管子，用21號針頭在石蠟膜上刺幾個孔。在旋轉真空干燥機上將其抽干。
為避免最后的測序膠上條帶模糊不清，必須徹底去除堿基持異切割反應中的哌啶。最好在凍干的情況下使用旋轉真空干燥機。依抽干機效率而言，此步常需要1~4小時。一些研究者傾向于在抽干前用干冰-乙醇溶冷凍樣品。

6. 取出小管。去除石蠟膜并加入20ul水。蓋上管蓋，渦旋振蕩30s溶解DNA。稍離心使溶液聚集在管底。使用手持微型計數器計數以確認管壁上的標記DNA已經完全被溶解在了水溶液中。

7. 重復一次，在旋轉真空干燥機上將其抽干，這一步依抽干機效率常需要15~30 min。
(參照第5步）。

8. 重復步驟6和7。
為了確保哌啶被完全除去. 一些研究者傾向于再次將DNA溶于10ul水并抽干。可是, 一般而言，只有在樣品呈油狀或者需要很長的抽干時間時才需要進行這一步。

9. 用切侖科夫（Cerenkov)記數器估計管中的放射活性，把修飾并切割后的反應物于測序膠緩沖液中。在柯達XAR-5膠片上的過夜曝光時，在一個堿基之后的切割反應物需要大約25000cpm(C和G 反應），在兩個堿基之后的切割反應物需要大約50000cpm(C+T，A+G,A>G)。所以，溶解在測序緩沖液中的C和G反應物要達到25000cpm/3ul; 而C+T,A+G和A>G反應物要達到 50000cpm/3ul。渦旋混合物使 DNA 完全溶解，稍離心使混合物聚集于管底。樣品可在-20°C 保存數小時。

10. 在 90°C 加熱 lmin 使 DNA 變性，在冰上驟冷。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果（參見方案 8，9,10,11 和 12)。