動物基因組DNA的分離純化實驗

實驗方法原理

根據核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進行分離, 然后用蛋白質變性沉淀劑去除蛋白,使核酸釋放出來, 再利用核酸不溶于乙醇的性質將核酸析出, 達到分離提純的目的。

在0 . 14 mol/ L 的氯化鈉溶液中, RNA 核蛋白(RNP) 溶解度大, 而DNA 核蛋白( DNP) 溶解度較小; 相反, 在1 mol/ L的氯化鈉溶液中, DNP 溶解度最大, 而RNP 溶解度卻很小, 從而使DNA、RNA 核蛋白分開。核蛋白分離后可用蛋白變性沉淀劑( 氯仿+ 異戊醇、十二烷基硫酸鈉、熱酚等) 去除蛋白質, 釋放核酸, 核酸便從溶液中析出。

動物肝中含有核糖核酸酶( RNase ) 和脫氧核糖核酸酶(DNase ) , 因此要保持低溫, 要防止Mg2+ , Fe2+ 及Co2+ 等激活離子。

實驗材料 蛋白質

試劑、試劑盒 檸檬酸鈉氯化鈉蒸餾水鹽酸SDS乙醇氯仿異戊醇

儀器、耗材 冷凍離心機組織搗碎機燒杯量筒玻璃棒三角燒瓶離心管

實驗步驟

新鮮豬肝4 g , 用SC 溶液洗去血液, 低溫剪碎后, 加入8 ml上述溶液, 繼續搗碎, 將勻漿物于4000 r/ min 離心10 min , 上層是RNP 提取液, 下層是DNP 及細胞碎片。將上層傾出( 也可留下制備RNA) , 下層再用5 ml SC 溶液重復抽提兩次, 以減少RNP 對DNP 抽提的影響。

下層沉淀移入三角燒瓶, 加同上溶液20 ml , 混勻, 加4 ml 5% SDS 混勻, 加15 ml 氯仿/ 異戊醇( 20/ 1 ) 混合液混勻,邊搖邊加固體氯化鈉, 使其終濃度達1 mol/ L, 充分振蕩30 min。4000 r/ min 離心20 min , 小心取出離心管, 觀察有三層, 上層為水相( DNA 溶解在此) , 中間乳白色為蛋白質沉淀層, 下層為氯仿層。用吸管小心吸取上層。同樣方法去蛋白, 至中間層無蛋白沉淀層為止。

量取上層水相體積后, 在燒杯中加等體積冷乙醇( 95%) ,邊加邊攪拌(沿一個方向) , 玻璃棒上有纖維狀DNA 纏繞, 當DNA 全部繞上后, 擠干, 再用無水乙醇洗一次, 取出于干燥器干燥。稱重, 計算得率。