制備和轉化感受態大腸桿菌的Inoue方法實驗

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 二甲亞砜 DMSO

二甲亞砜的氧化產物據推測為二甲硫醚，是轉化的抑制物（Hanahan 1985）。為避免上述問題，應購買高質量的 DMSO。

(2) Inoue 轉化緩沖液

用前置于冰上預冷至 0℃。

2. 核酸和寡核苷酸

質粒 DNA ( 重組質粒）

3. 培養基

(1) LB 或 SOB 培養基（培養最初的細菌生長物）

(2) SOB 瓊脂板，含 20 mmol/L MgSO₄ 和適當的抗生素。

標準的 SOB 瓊脂板含 10 mmol/L MgSO₄。

(3) SOB 培養基（培養轉化的細菌）

培養前，準備 3 個內盛 250 ml 18~20 ℃ SOB 的1 L 錐形瓶。

(4) SOC 培養液

每個轉化反應約需 1 ml。

4. 離心機和轉頭

Sorvall GSA 轉頭或與之相當的轉頭

5. 專用設備

液氮，聚丙烯管，18℃ 搖床，溫度可調 42℃ 的水浴裝置。

二、方法

1. 制備感受態細胞

(1) 準備 Inoue 轉化緩沖液（用前冰上預冷）。

① 0.5 mol/L 的 PIPES ( pH 6.7） [ 哌嗪-N, N'-雙（2-乙磺酸）] 溶液的配制：將 15.1 g PIPES 溶于 80 ml 水中（Milli-Q 級，或與之相當級別的 )，用 5 mol/L KOH 調 pH 值至 6.7，最后加純水，定容至 100 ml。用預先處理的 Nalgene 濾膜 ( 0.45 μm 孔徑）過濾除菌。分成小份于 -20℃ 保存。

② Inoue 轉化緩沖液的配制：將下列組分溶于 800 ml 純水中，然后加 20 ml 0.5 mol/ L PIPES ( pH 6.7)，然后加 20 ml 0.5 mol/L 的 PIPES （pH 6.7），加純水定容至 1 L。



③ 用預先處理的 Nalgene 濾膜（0.45 μm 孔徑）過濾除菌。分成小份于 -20℃ 保存。

(2) 挑取一個經 37℃ 培養 16~20 h 平皿上的單菌落 ( 2~3 mm 直徑)，接種至 250 ml 錐形瓶中的 25 ml LB 培養液或 SOB 培養液中，37℃ 搖床 ( 250~300 r/min) 培養 6~8 h。

(3) 晚上約 6 點鐘，將上述初始培養物接種于三個盛有 250 ml SOB 培養液的 1L 錐形瓶 中，第一個加 10 ml, 第二個加 4 ml, 第三個加 2 ml, 于 18~22℃ 中速搖床過夜。

(4) 次日早上，測量三瓶培養物的 OD₆₀₀ 值，每 45 min 測定一次。

(5) 當有一瓶的培養物 OD₆₀₀ = 0.55 時，將培養瓶置于冰上 10 min, 棄去另兩瓶培養物。

由于大多數實驗室的晝夜溫差較大，而且溫差也隨一年四季及工作人員數的變化而變化。因此，很難預測合適 OD 值的時期，尤其是晚上同時培養三瓶不同濃度梯度的菌液，可以提高成功的機會，培養過夜的菌液至少有一瓶是符合要求的。

(6) 于 4℃ 以 2500 g ( 相當于 Sorall GSA 轉頭，900 r/min) 離心 10 min 收集菌體。

(7) 倒去培養液，將離心管倒扣在吸水紙上 2 min 以吸干剩余液體，用一個真空吸引器將貼附在管壁上的培養基吸干。

(8) 加 80 ml 預冷的 Inoue 轉化緩沖液重懸細菌沉淀。

輕輕旋轉，不要用振蕩器或吹吸混勻。

(9) 于 4℃ 2500 g ( 相當于 Sorall GSA 轉頭 3900 r/min) 離心 10 min 收集菌體。

(10) 倒去上層培養液，將離心管倒扣在吸水紙上 2 min 以吸干剩余液體，用一個真空吸引器將附在管壁上的培養基吸干。

2. 凍存感受態細胞

(1) 用 20 ml 預冷的 Inoue 轉化緩沖液輕輕重懸沉淀。

(2) 加 1.5 ml DMSO。輕輕混勻細菌懸液，放置冰上 10 min。

(3) 迅速將懸液分裝到冷卻的無菌微量離心管中，封緊管口，沒入液氮中快速冰凍感受態細胞。貯存于 -70℃  備用。

(4) 需要時冰箱中取出一管感受態細胞，把管握于手心，融化細胞。細胞一經融化，立即把管轉移至冰浴中，在冰上放置 10 min。

(5) 用一冷的無菌吸頭把感受態細胞轉移到冷卻的無菌聚丙烯管（17X 170 mm) 中，放置在冰浴上。

不用玻璃管是因為它們會降低轉化效率約 10 倍。

3. 轉化

包括陽性和陰性對照。

(1) 將要轉化的 DNA 片段加入到裝有感受態細胞的管中（50 μl 感受態細胞需 25 ng DNA), 體積不應超過感受態細胞的 5%，輕輕旋轉幾次混勻內容物。實驗中至少設對照管：一個含有感受態細胞和已知量的超螺旋質粒 DNA，另一管只有感受態細胞。混勻內容物，冰浴 30 min。

(2) 將管放入預加溫至 42℃ 的循環水浴中，恰恰放置 90 s，不要搖動。

熱激是一個關鍵步驟，準確地達到熱激溫度非常重要。這里的溫度及溫育的時間都是使用 Falcon 2059 管 的測量參數，其他類型的管將可能獲得不同的結果。

(3) 快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻 1~2 min。

(4) 每管加 800 μl SOC 培養基，用水浴將培養基加溫至 37℃，然后將管轉移到設置為 37℃ 的搖床上，溫育 45 min，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。

為最大限度地提高轉化率，復蘇期中應溫和地搖動細胞（< 225 r/min）。

如果帶有 α 互補，請接 “ 用 X-gal 和 IPTG 篩選細菌菌落：α 互補”。

(17) 將適當體積（每個 90 mm 平板達 200 μl ) 已轉化的感受態細胞轉移到含 20 mmol/L MgSO4 和相應抗生素的 SOB 培養基上。

如果用四環素作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或軟瓊脂中），可以先在微量離心機上室溫離心 20 s以收集轉化菌，在輕拍管壁的同時加入 100 μl SOC 重懸沉淀。

重要：玻璃鋪菌器先需在乙醇中浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板表面。

如檢査氨芐青霉素的抗性，用轉化菌鋪平板時密度應較低（每個 90 mm 平板不超過 10⁴ 菌落 )，于 37℃ 培養的時間不超過 20 h。氰芐青霉素抗性的轉化體可將β-內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域的青霉素。這樣，鋪平板時密度過高或培養時間過長都會導致出現對氰芐青霉索敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60  μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加與平皿上所加的細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞釋放生長抑制物質的緣故。

(18) 將平板置于室溫直至液體被吸收。

(19) 倒置平皿，于 37℃ 培養，12~16 h 后可出現菌落。