分子雜交是通過配對堿基對之間的非共價鍵（主要是氫鍵）結合，從而形成穩定的雙鏈區。
雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行。
由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進行分子雜交時，應先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。