農桿菌感受態細胞制備實驗

在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl₂處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl₂溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。制備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍于-70℃可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。

土壤農桿菌LBA4404菌株

YEB液體培養基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸鎂 氯化鈣 利福平儲液

超凈工作臺 恒溫搖床 冷凍高速離心機 高壓滅菌鍋 冰箱 超低溫冰柜 分光光度計 接種針 試管 離心管 離心管 冰浴 微量進樣器 吸頭

1.  挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養過夜。

2.  取過夜培養菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養基中，28℃振蕩培養至OD₆₀₀為0.5。

3.  取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。

4、加入1000 ul 20 mM CaCl₂，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30 min。

5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 ul預冷的20 mM CaCl₂，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24 hr內使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存備用。