關于酶切的一些小技巧

A．找不到適合的酶切位點。由于各廠家不定期的推出新的限制性內切酶品種，這些酶切識別序列可能尚未在有關Catalog 上出現，用現有的軟件也查不到這些酶切點，如New England Biolabs 公司前一段時間剛推出了20多種新的內切酶。請隨時向各廠家或供應商查詢，并記得將新的品種加入到您的記錄中以便查閱，這些新的內切酶有可能正是您要找的呢。

B．在文獻上找到的內切酶在廠家目錄上找不到。由于來源不同，許多識別序列，酶切點完全本同的酶會有不同的名字，各供應商目錄往往會有相應的附錄以供用戶查詢，比如在New England Biolabs 的Catalog 后面20項或基因有限公司2000Catalag前面都附有相當完整的內切酶列表（含1999年以前絕大部分商品化的酶），從左邊一欄尋找你已知的酶的名字，找到后可以查出相應的識別序列，各種同功酶的名稱，
酶在NEB 廠家所用的名稱和目錄號等。另外也可以通過已知酶的識別序列在相應的表中找到相應的酶名稱。當然這些表可能不含最新發現的酶。

C．Dam Den 甲基化對酶切點的影響。有時用試劑盒純化的質粒用別的酶都切得動，用Bcl I ，等酶就是切不動。原因在于多數實驗室常用的Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個甲基化敏感的酶。當其識別序列被甲基化后BclI就出現切不動的情況。而Bam HI則對甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當你要用BclI這類切點時，請選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內切酶對甲基化敏感與否取決于其識別序列兩端的堿基，詳細資料請參考廠家目錄的有關附錄，如NEB 目錄268 、269 頁。

D．同進進行雙酶切要注意：

①任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的0.1②雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（NEB 目錄251 ）頁，如果有一種buffer能2 使種酶的活力都超過70% 的話，即可用這種buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可各取一半中和。

③如果2 個酶buffer成份相差較大或2 個酶的反應溫度不同則必需分別做酶切。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查詢各種酶的反應溫度。

④第一個酶切后可以電泳確證酶切完全后從膠中回收DNA 再進行下次酶切也可以在第一個酶切后用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣，保留少量做電泳分析之用后再進行下一次酶切。還有一種屯化管（eppendorf 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被甩掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入ddH2O 離心洗滌后加幾微升在膜上，將柱子反轉插入新的epperdorf 管上離心即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

⑤特別注意，雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序，因為不同的內切酶對其識別位點兩端堿基數目要求不同，有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的必須先切，比如LITMUS29中先切BamHI 再切Hind 時就會出現切不動的情況。更詳細的數據可參考相應的附錄，如NEB 公司目錄的259 頁。

E．設計合成引物時加入酶切點往往為后繼的實驗帶來很多方便，比如PRC 產物經酶切后可以定向克隆到載體中，但在設計時需注意不同的限制性內切酶對其識別位點兩端的堿基數目要求不同。例如HindⅡCla Ⅰ，要求其識別序列5 端至少有多個堿基，這個酶才能切動，有的內切酶在兩端堿基不同時切割效率也不同，設計引物時要特別注意。有關數據可查詢各供應商附錄表，如NEB 公司第258-259 頁。

F．小量酶切時用較小的管化1.5 的管好，可以減少因為蒸發造成的體積減少，濃度改變。