1、血液中丙酮酸脫氫酶復合物酶活力下降，酶活力檢測是診斷該病的金標準。
2、血、腦脊液乳酸和丙酮酸水平的測定：患者血清乳酸和丙酮酸水平常顯著升高，而乳酸/丙酮酸比例正常。如果血清乳酸正常，需要測定腦脊液乳酸和丙酮酸水平，患者腦脊液乳酸和丙酮酸水平通常升高，乳酸/丙酮酸比例正常。
3、丙酮酸脫羧酶活性測定：測定皮膚成纖維細胞、成淋巴細胞、肌肉組織或腦組織酶活性。
4、檢測PDHE1α亞單位、E1β亞單位、E3和E3結合蛋白基因是否存在突變。
5、影像學檢查：Leigh綜合征患者可見腦干和基底節對稱性病變，部分患者表現為腦發育不全、腦室擴張、皮質萎縮、胼胝體發育不全、側腦室移位等異常。
6、神經病理學的檢查：患者胼胝體可有不同程度缺失，也可伴有其他缺陷，如：小腦普肯野氏細胞和齒狀核不發育等異常。Leigh 綜合征患者基底節、被蓋部灰質、腦干、小腦、脊髓可見對稱性局灶性壞死、神經元消失、脫髓鞘改變和血管增生壞死。