三、顯色液
免疫細胞化學中，由于抗原-抗體反應所形成的復合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學基團的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine）顯色液
DAB即3，3-二氨基苯聯胺
試劑：DAB（常用四鹽酸鹽） 50mg
0.05mol/L TB 100ml
30% H2O2 30～40μl
配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H2O230～40μl，使其終濃度為0.01%。
DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標法、PAP法等），其終產物可直接在光鏡下觀察，也可經OsO4處理后，增加反應產物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作時應戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗，接觸DAB的實驗用品最好經洗液浸泡24h后使用。
2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）顯色液
配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg
純乙醇 10ml
0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml
30% H2O2 10μl(0.003%)
配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時間通常為5～20min。
配方2：4-Cl-1-萘酚
N-二甲基甲酰胺（DMF）
0.05mol/L TB(pH7.6)
30% H2O2
配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變為絮狀，在7.5℃加熱5min后加入H2O2，攪動使絮狀消失，趁熱過濾，當降至略低于50℃時才放入組織標本（注意：溫度過高易損傷標本，過低則易重新出現沉淀）。顯色時間通常為5min左右。
4-Cl-1-萘酚的終產物顯示藍色。
多數認為最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等認為，白色沉淀可作為背景，使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本，勿用酒精脫水。
3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）顯色液
試劑：AEC 20mg
二甲基甲酰胺（DMF） 2.5ml
0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5） 50ml
30%H2O2 25ml
配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2O2。切片顯色時間為5～20min。
該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
4．TMB顯色液
試劑：TMB
HCl
亞硝基鐵氰化鉀
無水酒精
配制方法：
（1）醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調至3.3。
（2）A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀，加蒸餾水92.5ml混合。
（3）B液：稱取5mg TMB加入2.5ml無水酒精中，可加熱至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
（4）孵育液：放入標本前數秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內應保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染）。酶反應時，加入終濃度為0.005%的H2O2。
（5）主要顯色步驟：組織標本在蒸餾水（或PBS）中漂洗數次（每次約10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）繼續孵育液20min左右（19℃～23℃），撈出標本漂洗數次（共30min左右）。在0～4℃條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負染2～3min，也可在1%派諾寧（pH3.3～3.5）中負染5min后貼片、脫水、封片。
TMB即四甲基聯苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強的基團，因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發色團。同時反應產物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應進行。TMB的反應產物為深藍色，利于光鏡觀察，且反應產物越聚越大，常超出單個細胞器的范圍（而DAB則被限制在其內），故TMB反應的檢測閾較低。由于上述優點，目前TMB常用于光鏡及超微結構水平的HRP及HRP-WGA神經投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應在2h內新鮮配制。另外，TMB是一種較強的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應帶手套及在通風條件下操作。
5．NBT顯色液
試劑A液：5%NBT：稱 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）內，充分混合，常存于4℃，也可裝成小份，-20℃保存，用前復溫。
B液：5% BCIP：稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內，混勻。4℃或分裝存于-20℃，用前恢復至室溫。
C．顯色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內，充分混勻；再加入B液40μl，輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。
NBT即四唑氮藍（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍色無定形微溶物質。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。當二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。
四、粘附劑
在免疫細胞化學工作中，由于標本（如切片）的脫落常影響工作的質量的速度，故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。
1．鉻礬明膠液
試劑：鉻礬 0.5g
明膠（Gelatine） 5g
H2O ~1000ml
方法：在1000ml的燒杯或燒瓶中，以500～800ml H2O加溫溶解明膠，待其完全溶解后，再加入鉻礬。注意溫度過高易使明膠燒糊，包被玻片時最好控制水溫在70℃。如有明顯殘渣，過濾后使用。
2．甲醛-明膠液
試劑：40%甲醛 2.5ml
明膠 0.5g
蒸餾水 至100ml
配制方法：用少許蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后，加入甲醛，最后補充蒸餾水至100ml混勻即可。
3．多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）
試劑：多聚賴氧酸 5g
蒸餾水 ~1000ml
配制方法：稱取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當稀釋配成0.01～0.5%濃度。4℃保存，也可-20℃備用。PLL可反復冰凍，效果無明顯影響，工作液常再稀釋10～50倍。
4．Vectabond試劑 該試劑是Vector公司新進推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學修飾作用，改變其表面的化學物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時間較久。一個試劑盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。處理載玻片前（事先酸處理），用染色缸裝好各種液體，按下列程序進行：
干凈載玻片→丙酮5min→Vectabond試劑工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃過夜）→用鋁箔包好，室溫存放備用。
注意：避免污染（塵埃等）。
綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。
五、封固劑
1．甘油-TBS及甘油-PBS
