免疫組化技術規范3

五、染色結果的觀察

1、陽性結果應定位在細胞相應的部位，在細胞膜表達的抗原陽性結果應定位在細胞膜上，在其他部位的陽性反應均為非特異性染色。不當的抗原修復會導致抗原在組織細胞中定位的改變。根據所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：

（1）細胞膜：如LCA和CD3、CD20等；

（2）細胞質：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；

（3）細胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。

2、組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現非特異性陽性表達。

3、染色結果呈陰性并非都是抗原不表達，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關。

4、組織切片背景深與下列因素有關：

（1）石蠟切片脫蠟不干凈；

（2）第一抗體濃度過高或孵育時間過長，溫度過高；

（3）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多；

（4）抗體不純；

（5）抗體孵育后切片清洗不干凈。

六、免疫組化實驗對照

為證實抗體和檢測試劑盒效價是否可靠，染色操作是否正確，一般需要進行實驗對照，以避免試劑失效或操作失當而出現假陰性和假陽性，確保染色結果的可靠性。

1、陽性對照：選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應呈陽性，此外組織中的內對照也是很好的陽性對照。

2、陰性對照：選用已知染色陰性的組織切片染色，其結果應為陰性。每次實驗中增加Vimentin染色作為對照，目的是觀察組織經福爾馬林固定后預期抗原表達的敏感性，按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來進行分析。Vimentin幾乎在任何組織中都有表達，尤其適合活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質中存在著大量的血管Vimentin可陽性表達，如果在同一張切片的間質中出現Vimentin染色微弱或部分區域變弱的情況，表明是不當的固定導致抗原破壞。所以在每批次實驗中應常規加入Vimentin染色，用于指導觀察福爾馬林固定后抗原表達敏感性情況。

七、抗體的保存和稀釋

一般來說，抗體應放在4℃冰箱中保存，第一抗體可分成小包裝于-20℃保存，使用時存放在4℃，不宜反復存放于4℃和-20℃之間，反復凍融會使抗體效價下跌。檢測系統一般不宜于-20℃保存，因為反復凍融使得與抗體結合的酶容易分解，導致檢測的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應根據說明書要求或自行摸索出的最佳工作濃度進行稀釋。可將抗體稀釋至1：10，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時間較長，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經過一定時間后應注意其效價時否有所降低，避免出現假陰性染色。

Nestin、PDGFR 可用于胃腸間質瘤的診斷指標，尤其對CD117陰性胃腸間質瘤在診斷上有很大的幫助，在國外已有文獻報導。這兩種抗體可用于常規固定的石蠟切片，經實驗證明Nestin 用PH8.0 EDTA高壓修復，PDGFR用PH6.0 檸檬酸微波修復效果較好。